Computationele en omics analyses voor het bekomen van nieuwe aanknopingspunten ter verbetering van Streptomyces lividans voor heterologe eiwitproductie

Naarmate het industriële en medische gebruik van enzymen toeneemt, intensifieert ook de zoektocht naar gastheerorganismen die deze enzymen heteroloog kunnen produceren. In dit opzicht gaat er steeds meer aandacht naar de bacterie Streptomyces lividans, voornamelijk vanwege interessante eigenschappen inzake eiwitsecretie. Dit proefschrift omvat een bijdrage aan de inspanningen van de wetenschappelijke gemeenschap om het organisme S. lividans te begrijpen en te modificeren, met als uiteindelijke doel het succesvolle gebruik als industrieel gastheerorganisme.

 De uitdaging om S. lividans te begrijpen en te verbeteren wordt vanuit verschillende hoeken benaderd. Naast directe inzichten in S. lividans en heterologe eiwitproductie, worden er verschillende methoden ontwikkeld die ook algemeen nuttig kunnen blijken voor het veld van computationele biologie. Verder wordt verwacht dat veel van de bevindingen voor S. lividans ook geldig blijven voor streptomyceten in het algemeen. Als modelenzyme doorheen dit werk wordt een hittebestendig cellulase A (CelA) gebruikt, een enzyme dat niet goed tot expressie kan gebracht worden in ’s werelds meest gebruikte gastheerorganisme E. coli.

Een bijgewerkt, modern, genoomschaal model van het S. lividans metabolisme wordt ontwikkeld en daarna gebruikt om genen te identificeren waarvan verwacht wordt dat verwijdering leidt tot hogere productie van CelA. Buiten het vinden van deze knockout targets in dit werk, kan dit metabole model een belangrijk hulpmiddel blijken voor andere stamverbeteringstechnieken of bij verder onderzoek. Bij het opstellen van dit model werd informatie gebruikt uit wetenschappelijke databases en literatuur, experimentele fenotypering, en wiskundige modellen. Het resulterende model bevat 1970 metabole reacties, 1494 metabolieten, en 1200 genen gelinkt aan reacties.

Het in silico voorspellen van metabole targets voor stamverbetering met het ontwikkelde genoomschaal model steunt op bestaande wiskundige methoden die trachten de metabole fluxverdeling in de wild-type stam te schatten, en dan een minimale verandering van deze flux trachten te vinden in de knockout stam. Aanpassingen aan deze bestaande algoritmes—die gericht zijn op het verhogen van de productie van metabolieten—geven de extra flexibiliteit die nodig is om ook targets te vinden voor het verhogen van eiwitproductie. Verder wordt er een nieuwe methode ontwikkeld om een biologisch meer accurate wild-type fluxverdeling te bekomen door rekening te houden met beschikbare genexpressiedata. In het totaal worden er zo 118 mogelijk voordelige knockout targets geïdentificeerd.

 De gevolgen van CelA productie en secretie op S. lividans werden vastgelegd in een studie van het transcriptoom en fluxoom. RNAsequencing en differentiële genexpressie t.o.v. de wild-type stam tonen een respons gerelateerd aan secretiestress, schade aan het DNA, alsook de activatie van het OsdR regulon. Dit regulon wordt geassocieerd met secundair metabolisme, hypoxie, intracellulaire signalering en morfologische ontwikkeling. Voor het groeperen van genen met differentiële expressie wordt een clusteringalgoritme gebruikt dat naast gelijkaardige genexpressie ook rekening houdt met de fysieke nabijheid van genen op het genoom. Op het fluxniveau toont een 13C metabole fluxanalyse dat CelA productie gepaard gaat met een verhoogde flux door de pentosefosfaatcascade en de citroenzuurcyclus, hetgeen leidt tot verhoogde NADPH-productie. De aangetoonde veranderingen in het transcriptoom en fluxoom geven aanknopingspunten om de metabole lasten die gepaard gaan met de productie en secretie van heteroloog eiwit verlichten, om zo een performantere S. lividans stam te bekomen.

Om de effecten van het groeimedium op de productie van CelA na te gaan worden het S. lividans transcriptoom en exometaboloom experimenteel bepaald bij groei in drie verschillende media: nutrient broth, nutrient broth met glucose, en casaminozuren met glucose. Bij groei in enkel nutrient broth toont S. lividans zeer lage groei, maar opvallend hoge CelA productie. De media met glucose, daarentegen, geven aanleiding tot hoge groei, maar lage CelA productie, alsook overflow van azijnzuur, pyrodruivenzuur, alanine en glutaminezuur. De lagere CelA productie in deze media suggereert dat sterke exponentiële groei en de daarop volgende activatie van het overflow metabolisme best vermeden worden voor heterologe eiwitproductie. Zowel principalecomponentenanalyse (PCA) als een differentiële expressieanalyse op de genexpressiedata suggereren dat het transcriptoom van S. lividans zich in een gelijkaardige staat bevindt in de twee media met glucose. Hoewel de PCA aantoont dat S. lividans zich weldegelijk in een andere toestand bevindt in het medium met enkel nutrient broth, brengt een analyse van differentiële expressie geen duidelijkheid over welke genen er verantwoordelijk zijn voor de hogere CelA productie.

Het verwijderen van genen die geen nut hebben in een industriële productieomgeving kan leiden tot verhoogde (heterologe) productie, en kan verdere verwerking van het reactormedium vereenvoudigen. Om de aanzet te geven tot een dergelijke genoomreductie worden mogelijke (groepen van) genen die verwijderd kunnen worden in silico voorspeld op basis van metabole modellen en genexpressiedata. De effecten van het verwijderen van metabole genen werden hiertoe gesimuleerd door middel van fluxbalansanalyse op een genoomschaal model van het S. lividans metabolisme. De resultaten worden gegeven als enkelvoudige genen en groepen van naburige genen die (samen) verwijderd kunnen worden zonder dat dit grote invloed heeft op de levensvatbaarheid.

In een laatste studie wordt in vivo transposon mutagenese gebruikt om een verzameling mutanten te bekomen waarmee de impact van gendisruptie op de levensvatbaarheid van S. lividans op grote schaal kan worden nagegaan. Door het ontwikkelen van nieuwe statistische methoden voor het analyseren van dergelijke transposon-sequencing data kan voor elk S. lividans gen de waarschijnlijkheid dat het essentieel is worden bepaald. Bovendien kan voor de niet-essentiële genen worden geschat wat de gevolgen van disruptie zijn op de groeisnelheid. Deze data kunnen een enorme bijdrage leveren bij het ondernemen van een genoomreductie van S. lividans, maar kunnen ook gebruikt worden als referentie alvorens het verwijderen van specifieke genen, of voor het maken van stammen die hogere of lagere groei vertonen.

Alles bij elkaar bevatten dit proefschrift en de bijgevoegde appendices in schat aan informatie over S. lividans—specifiek met betrekking tot heterologe eiwitproductie—alsook enkele concrete aanknopingspunten om S. lividans te verbeteren voor heterologe eiwitproductie door (i) het verminderen van de metabole lasten resulterende uit heterologe eiwitproductie, (ii) een genoomreductie, (iii) het omleiden van metabole fluxen en (iv) het manipuleren van de groeisnelheid.