< Terug naar vorige pagina
Project
Aptameer gebaseerde strategieën voor ultragevoelige proteïne detectie.
Recente ontwikkelingen maken dat het concept gepersonaliseerde geneeskunde op toenemende belangstelling kan rekenen. Het wordt verhoopt dat het in de nabije toekomst mogelijk zal worden om medische risicos beter in te schatten, zelfs voor de eerste ziekteverschijnselen zich manifesteren. Dit moet het mogelijk maken om, op basis van hun genetische achtergrond, patiënten sneller en beter te behandelen. Vooralsnog blijkt de sterk toegenomen beschikbaarheid van genetische informatie echter van beperkte waarde voor het individu. Het aantal bekende genetische merkers met bruikbare voorspellende kracht is voorlopig beperkt. Daarnaast is het menselijke genoom een uiterst complex geheel waarvan de werking moeilijk volledig te doorgronden is. Verschillende genen en hun onderlinge interacties blijken tussen te komen bij veel voorkomende ziekten zoals diabetesen vrijwel alle soorten kanker. Daarnaast blijkt dat ook omgevingsfactoren een belangrijke invloed kunnen hebben, los van de specifieke genetische achtergrond. Zelfs indien nuttige genetische merkers met hoge voorspellende kracht gevonden worden zal het doorgaans wenselijk zijn om het daadwerkelijke optreden van aandoeningen voegtijdig te detecteren. Op diemanier kunnen drastische of kostelijke preventieve ingrepen immers voorkomen worden zónder de prognose negatief te beïnvloeden.
Derhalve kangedetailleerde moleculaire informatie, aangeleverd door proteoom analyse, een waardevolle aanvulling betekenen op de beschikbare genetische informatie. In dat opzicht is het onontbeerlijk om te kunnen beschikken over methodes die het mogelijk maken om het grootste reservoir van proteïnemerkers in het menselijk lichaam, het bloed, op een efficiënte wijze teanalyseren. Wanneer bloed door het lichaam circuleert, zal het in contact komen met alle weefsels en zodoende bevat het essentiële informatie voor betere, meer gevoelige diagnostiek. Helaas is het op dit ogenblik verre van eenvoudig om op grote schaal proteomische informatie te verzamelen uit klinische stalen. Hoewel moderne genomische detectieplatformen tegenwoordig intensief gebruikt worden in wetenschappelijk onderzoek, hierbij geholpen door de inherente, zeer specifieke base-paring interacties tussen complementaire oligonucleotiden, blijkt het niet eenvoudig om dezelfde principes eenvoudig te vertalen naar proteomische analyse. Dit is in hoofdzaak te wijten aan het feit dat eiwit-eiwit interacties gedirigeerd worden door uiterst complexe -en vaak nog onvoldoend gekende- biofysische principes. In dit opzicht vormen aptameren een klasse van uiterst stabiele oligonucleotide liganden welke door hun unieke structuur over de mogelijkheid beschikken om andere biomolecules te herkennen, net zoalsantilichamen. Dit terwijl zij veel eenvoudiger en uiterst reproduceerbaar aangemaakt kunnen worden.
In dit proefschrift werd getracht om scheiding op basis van capillaire electroforese, polymerase kettingreactie amplificatie en oppervlakte plasmon resonantie te combineren met het oogop de ontwikkeling van nieuwe, uiterst gevoelige en uiterst specifieke methodes voor de kwantificatie minieme hoeveelheden proteïnes op basis van deze bekende technologieën. Dit werd mogelijk gemaakt dankzij de unieke affiniteitseigenschappen van DNA aptameren, hetgeen toeliet om nieuwe, krachtige signaalversterkingsstrategieën te gebruiken in combinatie met CE- en SPR detectie.
In eerste instantie werd traditionele, kolom gebaseerde, detectie in aptameer affiniteits capillaire elektroforese vervangen door kwantitatieve PCR amplificatie van aptameren. Hiertoe werdenin silico modellen voor oligonucleotide smeltgedrag gebruikt om primer sequenties te ontwikkelen die vervolgens ge- bruikt konden worden voor de amplificatie van aptameren met hoge specificiteit en gevoeligheid zonder de aptameer affiniteit negatief te beïnvloeden. Het principe werd gedemonstreerd voor de detectie van minieme hoeveelheden immunoglobuline E.Hierbij kon een verlaging van de detectiegrens met ten minste drie ordes van grootte aangetoond worden. Vervolgens werd qPCR gebaseerde affiniteits capillaire elektroforese verder ontwikkeld om meervoudige proteïne detectie mogelijk te maken met behoud van dezelfde ultra-lage detectielimieten. Hiertoe werd het rationele ontwerp van primer sequenties verder uitgebreid om de afzonderlijke kwantificatie van meerdere analyten mogelijk te maken zonder dat het strikt noodzakelijk is om alle aptameer- doelwit complexen volledig te resolveren tijdens de elektroforese. Dit maakt de gelijktijdige detectie van picomolaire concentraties van drie relevante proteïnes, humaan α-trombine, humaan immunoglobuline E enHIV reverse transcriptase 1 mogelijk.
De capaciteit van aptameer affiniteit capillaire elektroforese werd vervolgens nog verder uitgebreid dankzij de massale parallellisatie mogelijkheden van next-generation sequencing. Op deze manier werden de aptameer sequenties zelf gebruikt alseen streepjescode voor hun respectieve proteïnes. Er werd aangetoond hoe aptameren kunnen worden aangepast om hen compatibel te maken met next-generation sequencing. De identificatie en kwantificatie van individuele aptameren in een complex mengsel kon aangetoond worden en next-generation sequencing werd vervolgens gebruikt in de aptameer affiniteit capillaire elektroforese detectie van humaan immunoglobuline E in een klinisch
serumstaal.
In het tweede deel van dit proefschrift, werden glasvezel-SPR gebaseerde detectieplatformen voor proteïne detectie ontwikkeld. Hierbij werden nieuwe strategieën geëvalueerd waarbij DNA als mediator in het detectieproces werd gebruikt. Het gebruik van DNA laat toe om enzymatische methodes voor DNA amplificatie te gebruiken om uiteindelijk meer specifieke en gevoeligere SPR gebaseerde proteïne assays mogelijk te maken.
Eerst werd aangetoond hoe glasvezel SPR systemen gebruikt kunnen worden voor de sequentie-specifieke detectie van korte DNA oligonucleotiden, zelfs in de aanwezigheid van componenten in het staal die normaal zouden interfereren met SPR detectie. De haalbaarheid van de aanpak werd gedemonstreerd aan de hand van de serotypering van het bacterium Legionella pneumophila. De sequentie specifieke discriminatie van verschillende aptameer sequenties zal uiteindelijk echter ook bijdragen tot parallelle glasvezel SPR gebaseerde aptameer-assays.
Tot slot werd het eerder gepresenteerde DNA hybridisatie assay verder ontwikkeld om, naast sequentie-specifieke detectie van korte DNA-sequenties, ook de detectielimieten van de glasvezel-SPR sensoren te verhogen door te tonen hoe de techniek gebruikt kan worden voor real-time detectie van een heterogene SPR amplificatie van een DNA aptameer. Dit is een belangrijke stap op weg naar glasvezel-SPR gebaseerde ultra-gevoelige eiwit detectie met behulp van aptameren.
Derhalve kangedetailleerde moleculaire informatie, aangeleverd door proteoom analyse, een waardevolle aanvulling betekenen op de beschikbare genetische informatie. In dat opzicht is het onontbeerlijk om te kunnen beschikken over methodes die het mogelijk maken om het grootste reservoir van proteïnemerkers in het menselijk lichaam, het bloed, op een efficiënte wijze teanalyseren. Wanneer bloed door het lichaam circuleert, zal het in contact komen met alle weefsels en zodoende bevat het essentiële informatie voor betere, meer gevoelige diagnostiek. Helaas is het op dit ogenblik verre van eenvoudig om op grote schaal proteomische informatie te verzamelen uit klinische stalen. Hoewel moderne genomische detectieplatformen tegenwoordig intensief gebruikt worden in wetenschappelijk onderzoek, hierbij geholpen door de inherente, zeer specifieke base-paring interacties tussen complementaire oligonucleotiden, blijkt het niet eenvoudig om dezelfde principes eenvoudig te vertalen naar proteomische analyse. Dit is in hoofdzaak te wijten aan het feit dat eiwit-eiwit interacties gedirigeerd worden door uiterst complexe -en vaak nog onvoldoend gekende- biofysische principes. In dit opzicht vormen aptameren een klasse van uiterst stabiele oligonucleotide liganden welke door hun unieke structuur over de mogelijkheid beschikken om andere biomolecules te herkennen, net zoalsantilichamen. Dit terwijl zij veel eenvoudiger en uiterst reproduceerbaar aangemaakt kunnen worden.
In dit proefschrift werd getracht om scheiding op basis van capillaire electroforese, polymerase kettingreactie amplificatie en oppervlakte plasmon resonantie te combineren met het oogop de ontwikkeling van nieuwe, uiterst gevoelige en uiterst specifieke methodes voor de kwantificatie minieme hoeveelheden proteïnes op basis van deze bekende technologieën. Dit werd mogelijk gemaakt dankzij de unieke affiniteitseigenschappen van DNA aptameren, hetgeen toeliet om nieuwe, krachtige signaalversterkingsstrategieën te gebruiken in combinatie met CE- en SPR detectie.
In eerste instantie werd traditionele, kolom gebaseerde, detectie in aptameer affiniteits capillaire elektroforese vervangen door kwantitatieve PCR amplificatie van aptameren. Hiertoe werdenin silico modellen voor oligonucleotide smeltgedrag gebruikt om primer sequenties te ontwikkelen die vervolgens ge- bruikt konden worden voor de amplificatie van aptameren met hoge specificiteit en gevoeligheid zonder de aptameer affiniteit negatief te beïnvloeden. Het principe werd gedemonstreerd voor de detectie van minieme hoeveelheden immunoglobuline E.Hierbij kon een verlaging van de detectiegrens met ten minste drie ordes van grootte aangetoond worden. Vervolgens werd qPCR gebaseerde affiniteits capillaire elektroforese verder ontwikkeld om meervoudige proteïne detectie mogelijk te maken met behoud van dezelfde ultra-lage detectielimieten. Hiertoe werd het rationele ontwerp van primer sequenties verder uitgebreid om de afzonderlijke kwantificatie van meerdere analyten mogelijk te maken zonder dat het strikt noodzakelijk is om alle aptameer- doelwit complexen volledig te resolveren tijdens de elektroforese. Dit maakt de gelijktijdige detectie van picomolaire concentraties van drie relevante proteïnes, humaan α-trombine, humaan immunoglobuline E enHIV reverse transcriptase 1 mogelijk.
De capaciteit van aptameer affiniteit capillaire elektroforese werd vervolgens nog verder uitgebreid dankzij de massale parallellisatie mogelijkheden van next-generation sequencing. Op deze manier werden de aptameer sequenties zelf gebruikt alseen streepjescode voor hun respectieve proteïnes. Er werd aangetoond hoe aptameren kunnen worden aangepast om hen compatibel te maken met next-generation sequencing. De identificatie en kwantificatie van individuele aptameren in een complex mengsel kon aangetoond worden en next-generation sequencing werd vervolgens gebruikt in de aptameer affiniteit capillaire elektroforese detectie van humaan immunoglobuline E in een klinisch
serumstaal.
In het tweede deel van dit proefschrift, werden glasvezel-SPR gebaseerde detectieplatformen voor proteïne detectie ontwikkeld. Hierbij werden nieuwe strategieën geëvalueerd waarbij DNA als mediator in het detectieproces werd gebruikt. Het gebruik van DNA laat toe om enzymatische methodes voor DNA amplificatie te gebruiken om uiteindelijk meer specifieke en gevoeligere SPR gebaseerde proteïne assays mogelijk te maken.
Eerst werd aangetoond hoe glasvezel SPR systemen gebruikt kunnen worden voor de sequentie-specifieke detectie van korte DNA oligonucleotiden, zelfs in de aanwezigheid van componenten in het staal die normaal zouden interfereren met SPR detectie. De haalbaarheid van de aanpak werd gedemonstreerd aan de hand van de serotypering van het bacterium Legionella pneumophila. De sequentie specifieke discriminatie van verschillende aptameer sequenties zal uiteindelijk echter ook bijdragen tot parallelle glasvezel SPR gebaseerde aptameer-assays.
Tot slot werd het eerder gepresenteerde DNA hybridisatie assay verder ontwikkeld om, naast sequentie-specifieke detectie van korte DNA-sequenties, ook de detectielimieten van de glasvezel-SPR sensoren te verhogen door te tonen hoe de techniek gebruikt kan worden voor real-time detectie van een heterogene SPR amplificatie van een DNA aptameer. Dit is een belangrijke stap op weg naar glasvezel-SPR gebaseerde ultra-gevoelige eiwit detectie met behulp van aptameren.
Datum:3 mrt 2008 → 6 mrt 2013
Trefwoorden:BMP-2 Biosensors
Disciplines:Anorganische chemie, Organische chemie, Theoretische en computationele chemie, Andere chemie
Project type:PhD project