Analyse van dsRNA-toedieningswijzen en resistentiemechanismen tegen RNAi bij insecten

Chemische plaagbestrijdingsmethoden zijn vooralsnog de meest toegepaste strategie in de strijd tegen plaaginsecten. Het gebruik van deze chemicaliën kan echter een aantal gevaarlijke neveneffecten teweegbrengen. Door hun aspecifieke werkingswijze en slechte biologische afbraak, hebben deze chemische insecticiden een zeer negatieve impact op het milieu. Bovendien kunnen buiten het plaaginsect ook gunstige insectsoorten aangetast worden, wat een enorme invloed zal hebben op lokale ecosystemen. Daarbuiten wordt steeds vaker vastgesteld dat plaaginsecten resistentie ontwikkelen tegen de meest gebruikte chemische insecticiden. Samengevat betekent dit dat er een constante zoektocht is ontstaan naar alternatieve manieren om plaaginsecten op een efficiënte en milieuvriendelijke wijze te kunnen bestrijden.

RNA-interferentie (RNAi) heeft zich ontpopt tot een zeer interessante kandidaat voor verdere toepassing als een alternatieve gewasbeschermingsmethode, voornamelijk doordat dit mechanisme op een zeer sequentie-specifieke manier voor post-transcriptionele neerregulatie van genen kan zorgen. Deze toepassing is enkel mogelijk op voorwaarde dat het doelwit plaaginsect een systemische RNAi respons kan induceren na toediening van dubbelstrengig (ds)RNA via de voeding. Het blijkt echter dat veel economisch relevante plaagsoorten hier niet toe in staat zijn. Dit vormt uiteraard een belangrijke barrière in de verdere ontwikkeling van RNAi als een universeel insecticide. 

dsRNA toedieningssystemen kunnen een interessante oplossing bieden voor dit probleem. Deze transportmechanismen zijn specifiek ontworpen om dsRNA opname te bevorderen en het te beschermen tegen afbraak in agressieve extracellulaire omgevingen. In deze thesis zullen wij daarom verschillende kandidaat dsRNA toedieningssystemen onderzoeken: 5 verschillende ‘cell penetrating peptides’ (CCPs), een Galanthus nivalis agglutinin (GNA-) dsRNA bindings domein (dsRBD) fusieproteïne en een dsRNA-producerende bacterie streng. Het vermogen van de geselecteerde kandidaten om op te kunnen treden als een dsRNA toediengssysteem zal geëvalueerd worden aan de hand van 3 belangrijke selectiecriteria: de stabiliteit van het systeem in een ex vivo insecten darmomgeving, de mogelijkheid van het systeem om in vitro de cellulaire opname van dsRNA te bevorderen in twee omgevings RNAi-ongevoelige insecten cellijnen, Sf9 en Cl8, en het vermogen van het systeem om in vivo een RNAi respons uit te lokken na toediening via de voeding, of injectie in de Florida-uil Spodoptera exigua, en/of de woestijnsprinkhaan Schistocerca gregaria, twee verwoestende plaagsoorten.

Hoewel geen enkele van de geselecteerde toedieningssystemen in vivo onder de geteste condities een knockdown kon induceren, werden toch een aantal zeer interessante resultaten behaald. Twee CPPs, EB1 en C6M1, stimuleerde cellulaire opname van zowel dsRNA als siRNA in Sf9 en Cl8. Verder kon het EB1:siRNA complex ook in vivo voor cellulaire opname zorgen na injectie in de hemolymfe van S. gregaria. Bovendien bleek het GNA-dsRBD fusieproteïne in staat om dsRNA te beschermen tegen afbraak in een ex vivoS. exigua darm omgeving. Daarnaast zorgde het GNA-dsRBD ook voor opname van dsRNA en siRNA in Cl8 cellen, maar niet in Sf9. Tenslotte, kon het bacterieel toedieningssystem voor een systemische RNAi respons zorgen na injectie in de hemolymfe van S. gregaria. In een poging om ook de opnamemechanismen voor dsRNA en dsRNA toedieningssystemen verder op te helderen, werd uiteindelijk ook een vermeende S. gregaria scavenger receptor klasse C sequentie geïdentificeerd. De functionele rol van deze sequentie in RNAi werd verder onderzocht door een RNAi-op-RNAi toenadering. De behaalde resultaten bieden nieuwe en interessante perspectieven op de toepasbaarheid van dsRNA toedieningssystemen in insecten.