Identificatie van interactieplaatsen in het TL4-MAL-MyD88 complex en TLR4-TRAM-TRIF complex via MAPPIT en random mutagenese

Het aangeboren immuunsysteem vormt de eerste verdedigingslinie van het menselijk lichaam tegen indringende pathogenen. Dit defensiemechanisme herkent pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen via patroon-herkennende receptoren (PRRs). PRRs worden onderverdeeld in verschillende families, waaronder de Toll-like receptor (TLR) familie. De TLR familie omvat 10 humane leden die elk hun eigen set aan liganden herkent. Na ligand detectie worden er adapter eiwitten naar de TLR gerekruteerd en wordt de intracellulaire signaalbaan geactiveerd. Naargelang de gestimuleerde TLR worden er twee mogelijke signaalbanen geïnduceerd. De eerste signaalbaan is afhankelijk van het adapter eiwit MyD88 en leidt tot de activering van de NF-U+03BAB transcriptiefactor familie en de productie van pro-inflammatoire cytokines. De tweede signaalbaan wordt gestuurd door het adapter eiwit TRIF en induceert de productie van interferon. De interacties tussen receptoren en adapter eiwitten vormen een belangrijke stap in beide signaalbanen en worden gecoördineerd door een gemeenschappelijk domein dat het TIR domein wordt genoemd. Tot op heden zijn reeds verscheidene TIR domein structuren bepaald in zowel receptor als adapter eiwitten. Toch heerst er nog steeds onduidelijkheid over hoe TIR domeinen precies met elkaar interageren. Ook wordt er intensief onderzoek gevoerd naar de activering van MyD88. Enerzijds wordt de MyD88 activering gecontroleerd door fosforylering van twee serine residuen in het MyD88 TIR domein. Het volledig mechanisme is echter nog onbekend. Anderzijds veroorzaken diverse mutaties in MyD88 een ongecontroleerde activering. Deze mutaties werden recentelijk geïdentificeerd in verschillende ziekten, zoals lymphoma en artritis. Meer inzicht in de werking van MyD88 kan een belangrijke sleutel vormen in de ontwikkeling van therapeutische behandelingen. In dit werk bestudeerden we de interacties van de adapter eiwitten MyD88 en TRIF. We brachten eerst willekeurige mutaties aan in hun TIR domeinen. Daarna onderzochten we het effect van elke mutatie op de binding van het gemuteerde eiwit met zijn interactiepartners via de U+201CAmmalian Protein-Protein Interaction TrapU+201D(MAPPIT) techniek. In deze techniek werden de TIR domeinen van twee interactiepartners gekoppeld als lokaas en prooi. De interactie tussen lokaas en prooi induceerde een MAPPIT luciferase signaal dat evenredig is met de sterkte van de interactie. Het effect van de mutatie op de structuur van het TIR domein werd gecontroleerd door de FoldX predictie server. Mutaties die de structuur verstoorden, werden uit onze verdere analyse geweerd. Vervolgens werden potentiële interactiesites in de TIR domeinen van MyD88 en TRIF verder onderzocht door co-immunoprecipitatie experimenten en NF-U+03BAB en IRF3 activatietesten. Het eindresultaat bevestigde reeds gekende interactiesites, maar leidde ook tot de ontdekking van nieuwe interactiesites. Deze kennis liet ons toe om computermodellen te genereren die de interacties van MyD88 of TRIF met hun interactiepartners weergeven. Ook toonden we voor de eerste keer aan hoe de TIR domeinen van MyD88 een oligomeer complex vormen, dat het Myddosoom wordt genoemd. Tijdens deze thesis werd de cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structuur van het Mal TIR domein bepaald. Deze structuur leverde een nieuwe kijk op TIR-TIR interacties. We besloten daarom om onze vorige data over de TIR domeinen van Mal en TLR4 samen met de huidige data over de TIR domeinen van MyD88 en TRIF te herinterpreteren met de cryo-EM structuur van het Mal TIR domein als leidraad. Dit stelde ons in staat om TIR-TIR interacties verder te verduidelijken en om modellen te genereren voor de TLR4/Mal/MyD88, TLR4/TRAM/TRIF en TLR3/TRIF complexen. Daarnaast focusten we ons op het activeringsmechanisme van MyD88. We bootsten de fosforylering van het MyD88 TIR domein na via twee serine-naar-aspartaat mutaties (S242D en S244D). Ook onderzochten we twee specifieke mutaties die MyD88 automatisch activeren. De eerste mutatie, MyD88 L265P, is geassocieerd met verschillende types van humaan B-cel lymphoma en in het bijzonder met WaldenströmU+2019s macroglobulinemia (WM). De tweede mutatie, MyD88 S222R, is recentelijk ontdekt in ernstige artritis. Het effect van deze vier mutaties op de MyD88 interacties werd uitgebreid onderzocht via MAPPIT experimenten en NF-U+03BAB activeringstesten. De invloeden van de mutaties op de structuur van het MyD88 TIR domein werden geanalyseerd via moleculaire dynamica simulaties. Deze werkwijzen gaven ons een unieke kijk op de activering van het TIR domein. De mutaties introduceerden namelijk structurele veranderingen waardoor het MyD88 TIR domein een actieve conformatie aanneemt. Deze vondst verklaarde waarom fosforylering van MyD88 vereist is voor zijn activering. Daarnaast werd de ontregelde werking van MyD88 in zowel WM als ernstige artritis verduidelijkt. Deze kennis kan mogelijks van pas komen bij de ontwikkeling van nieuwe behandelingen