De rol van trehalose-biosynthese-enzymen in de virulentie en stresstolerantie van de menselijke schimmelpathogenen Candida glabrata en Candida auris

Er is een toename van infecties veroorzaakt door menselijke schimmelpathogenen. De onderliggende reden is dat er een verhoogde resistentie is tegen de weinige klassen antischimmelmiddelen die in de kliniek worden gebruikt. Bovendien zorgt de vooruitgang van de geneeskunde ervoor dat mensen ouder worden, maar hun immuunsysteem zwakker wordt, waardoor ze kwetsbaarder worden voor schimmelinfecties. Ook veroorzaakt het toegenomen gebruik van verschillende implantaatmaterialen een toename van biofilm-gerelateerde infecties, aangezien schimmelcellen zich hechten aan dergelijke implantaten en vervolgens een biofilm produceren. Cellen in zo'n biofilm zijn veel moeilijker te behandelen. De meest voorkomende geïsoleerde soort is Candida albicans, maar er is een gestage toename van de incidentie van Candida glabrata-infecties. De reden hiervoor is dat deze soort toleranter is voor verschillende soorten stress, waaronder antischimmelmiddelen. Naast C. glabrata is er een nieuwe jongen in de buurt, namelijk C. auris. Deze soort is pas recentelijk verschenen (eerste geval in Japan in 2009), maar kan worden beschouwd als de MRSA onder schimmelpathogenen omdat hij ziekenhuisuitbraken kan veroorzaken. Deze soort is vaak multiresistent. In ons vorige werk hebben we ons veel gericht op het metabolisme van trehalose en het mogelijke rol ervan als nieuwe doelwitten voor antischimmelmiddelen. Trehalose is een disaccharide van twee glucosemonomeren, maar niet-reducerend en staat bekend om zijn stressbeschermende eigenschappen. Droge gist bevat bijvoorbeeld 20% trehalose. Trehalose wordt geproduceerd in een tweestapsreactie waarbij UDPglucose en glucose-6P worden gebruikt om trehalose-6P te produceren (door de activiteit van trehalose-6P-synthase, Tps1) dat vervolgens wordt gedefosforyleerd tot trehalose (door de activiteit van trehalose-6P-fosfatase, Tps2). We hebben eerder aangetoond dat het Tps2-enzym een zeer interessant antifungaal geneesmiddeldoelwit is, aangezien de deletie ervan de productie van het stressbeschermende molecuul trehalose verhindert en resulteert in de accumulatie van Tre-6P, waardoor vrij Pi uit het centrale metabolisme wordt verwijderd. Inderdaad, een tps2-mutant is sterk aangetast in zijn virulentie (Van Dijck et al. 2002). Tot dusver zijn de biosynthese-enzymen van trehalose niet onderzocht in C.glabrata, en er zijn aanwijzingen dat het metabolisme van trehalose erg belangrijk kan zijn, aangezien er zelfs een test bestaat om C. glabrata te identificeren, met behulp van een trehalase-assay. Ook bij C. auris is het metabolisme van trehalose nog niet onderzocht. In dit project zijn we van plan om: 1. Genereer deleties in de C. glabrata en C. auris TPS1- en TPS2-genen en genereer gereconstitueerde stammen. We ontwikkelden CRISPR-Cas9 voor gebruik in C. glabrata en we ontwikkelden ook stammen met een defect in niet-homologe endjoining, wat de kans vergroot om een correcte deletiemutant te identificeren (Cen et al., 2015; Cen et al., 2017). 2. Fenotypische karakterisering van de deletiemutanten. We zullen de trehalose-niveaus, osmotische en temperatuurstresstolerantie, antischimmelgeneesmiddeltolerantie bepalen. We zullen ook virulentiekenmerken bepalen, zoals het vermogen om biofilms te vormen, adhesie- en virulentie-assays in geschikte diermodelsystemen 3. We zullen de rol van het trehalosemetabolisme bij de controle van glycolyse onderzoeken en bepalen of er, net als S. cerevisiae (Peeters et al., 2017 Nat Commun) een verband is met de Ras-route en apoptose. 4. We zullen onze interne samenstellingenbibliotheken (verzameling van essentiële oliën van planten en 360 fermentatieproducten voor bodemmicroben) screenen om verbindingen te identificeren die de Tps2-enzymen van beide soorten kunnen remmen. Dit kan leiden tot loodverbindingen voor verdere ontwikkeling van geneesmiddelen. Aan het einde van het project zouden we een duidelijk beeld moeten hebben van de rol van het trehalosemetabolisme in beide soorten en of deze enzymen belangrijk zijn voor virulentie. We hebben misschien ook al moleculen geïdentificeerd die deze enzymen zouden remmen.