Ontwikkeling van een xylose-gebruikende Saccharomyces cerevisiae celfabriek voor de productie van muconzuur en protocatechuïnezuur

De huidige maatschappij is gevormd door fossiele brandstoffen en hun wijdverspreid gebruik met impact op de geologie en ecosystemen van de aarde met de antropogene klimaatsverandering tot gevolg. Vele producten die we dagelijks gebruiken zijn gemaakt van chemicaliën die afkomstig zijn van fossiele brandstoffen. De shift van een fossiel-gebaseerde economie naar een meer duurzame, bio-gebaseerde economie vereist het ontwikkelen van alternatieve productieroutes die gebruik maken van goedkope en hernieuwbare biomassa, zoals lignocellulose. De gist Saccharomyces cerevisiae is uitgebreid aangepast om zowel hexose als pentose suikers in lignocellulose hydrolysaten om te zetten naar ethanol. Deze stammen zijn ook ideale kandidaten om celfabrieken te construeren voor andere platform chemicaliën. Er zijn vele interessante platform chemicaliën maar in dit werk focussen we ons op twee: muconzuur en protocatechuïnezuur (PCA).

Muconzuur kan omgezet worden naar adipinezuur en tereftaalzuur, dewelke twee zuren zijn die momenteel geproduceerd worden op een industriële schaal maar berusten op fossiel-gebaseerde grondstoffen. Bovendien bied muconzuur zijn twee dubbele bindingen een grote flexibiliteit voor chemische modificatie. PCA kan dienen als een basisstof voor de productie van catechol of benzeen. Het gebruiken van cellfabrieken voor het produceren van niet-eigen chemische stoffen is reeds uitvoerig bestudeerd, ook voor muconzuur specifiek. Echter, de behaalde titer en opbrengsten zijn ver van diegene die nodig zijn voor industriële opschaling en de best presterende bacteriële celfabrieken zijn niet geprefereerd door hun inferieure robuustheid in industriële opstellingen. Dit is waarom tweede-generatie industriële S. cerevisiae stammen beschouwd worden als een veelbelovend alternatief.

In het eerste deel van dit werk construeren we een xylose-gebruikende gist celfabriek voor de productie van muconzuur. We hebben succesvol zes kopieën van de muconzuur signaalweg (MApw), bestaande uit drie heterologe genen, geïntroduceerd en tot expressie gebracht alsook de ethanol productie gestopt door het uitknokken van de drie PDC genen in de industriële giststam T18HAA1. Bovendien is de conversie van de heterologe intermediair PCA naar muconzuur verbeterd door verhoogde expressie van het PCA decarboxylase (PCAD), resulterend in de best producerende stam TN22. Deze stam produceerde maximale muconzuur titers van 4,000 mg/L (33.6 mg/g koolstof), 4,500 mg/L (37.3 mg/g koolstof) en 3,800 mg/L (30.7 mg/g koolstof) in medium met glucose, xylose of een mix van beiden, respectievelijk. Tot nu doe zijn dit de hoogste gerapporteerde muconzuur titers in batch fermentaties met gist als celfabriek. Echter, we ondervonden dat muconzuur een inhiberend effect heeft op de suiker consumptie, groei en muconzuur productie, vooral bij een lagere pH. In-situ product verwijdering met polypropyleen glycol (PPG) verlaagde de muconzuur concentraties in het fermentatiemedium, maar dit was niet voldoende om de fermentatiecapaciteit te herstellen. Verdere observaties toonden aan dat de oorzaak van het stoppen van de fermentatie niet alleen komt door de toxiciteit van muconzuur maar mogelijks ook door een onbekende, mogelijks metabolische bottleneck. Met de TN22 stam konden we ook een titer van 2,900 mg/L (26.4 mg/g koolstof) muconzuur produceren van maïskolf hydrolysaat wanneer PPG toegevoegd werd.

In het tweede deel van dit werk gebruikten we gelijkaardige strategieën voor het construeren van een xylose-gebruikende gist celfabriek voor de productie van PCA. Bovendien werd de koolstof-flux naar PCA verbeterd, wat resulteerde in de TN23 ric1Δ/RIC1 stam. Deze stam produceerde maximale titers van 7,700 mg/L (65 mg/g koolstof), 5,200 mg/L (43 mg/g koolstof) en 6,700 mg/L (54 mg/g koolstof) in medium met glucose, xylose of een mix van beiden, respectievelijk. Opnieuw werd een incomplete consumptie en een halt van de fermentatie vastgesteld. Dit is het eerste rapport over een gist celfabriek die PCA produceert als target chemicaliën.

In beiden gevallen zorgde het stoppen van de ethanol productie in de ontwikkelde stammen tot de noodzaak om een C2 component, zoals ethanol, toe te voegen aan het medium. De strategieën om een C2 onafhankelijke stammen te maken bleken niet voldoende en vereist verder onderzoek. Zowel TN22 als TN23 ric1Δ/RIC1 kunnen dienen als preliminaire platformstammen voor de productie van muconzuur of PCA, respectievelijk, met verder onderzoek naar toxiciteit, C2 autotrofie en verbeteren van de suikerconsumptie.