< Terug naar vorige pagina
Project
Nanobodies om niet-canonieke DNA-structuren te herkennen en hun vorming in vivo te reguleren (OZRIFTM7)
In 1953 presenteerden Watson en Crick hun iconische structuur van dubbelstrengs DNA. Sindsdien staat deze structuur stevig in het culturele geheugen van de mensheid gegrift. Maar DNA is ook in staat andere structuren aan te nemen die alleen in bepaalde contexten voorkomen. Alom bekend zijn bijvoorbeeld de zogenaamde G-kwadruplexen (G4), gevormd uit G-rijke sequenties, en i-motieven, gevormd uit de complementaire streng. Hoewel deze structuren uitvoerig zijn bestudeerd, is hun rol in de genregulatie en hun verband met ziekten zoals kanker, de ziekte van Alzheimer en diabetes nog steeds het onderwerp van uitgebreid onderzoek. Traditioneel werden niet-canonieke DNA-structuren in vitro bestudeerd en hun bestaan in cellen was controversieel. Deze kwestie werd opgehelderd door baanbrekende studies gebaseerd op de detectie van G4 en i motieven met specifieke antilichamen ontwikkeld met behulp van synthetische antilichaam bibliotheken.
Onlangs werd een nieuwe vouw van een niet-canonieke DNA-structuur ontdekt, AGCGA quadruplex genaamd. Op sequentieniveau houden deze structuren zich vast aan een herhaling van het AGCGA-motief. Op structureel niveau worden deze quadruplexen gestabiliseerd door G-A en G-C basenparen die GAGA- en GCGC-quadruplexen vormen. In tegenstelling tot G-quadruplexen worden deze structuren niet gestabiliseerd door specifieke kationbinding en zijn zij dus ongevoelig voor de aard van het kation. De bio-informatica studie heeft AGCGA quadruplex sequentiemotieven geïdentificeerd in meer dan 40 menselijke genen die geassocieerd worden met de regulatie van basale cellulaire processen, neurologische aandoeningen, kanker, en afwijkingen in bot- en kraakbeenontwikkeling, terwijl mutaties van de motieven in verband zijn gebracht met autisme.
Het hoofddoel van het voorgestelde project is te bepalen of AGCGA quadruplexen in vivo worden gevormd. Dit vereist de ontwikkeling van detectiemiddelen, specifieke liganden, die AGCGA quadruplexen herkennen in de cellulaire natieve context. Wij zijn van plan om een panel van nanobodies (enkel-keten kameelachtige antilichamen) te ontwikkelen die specifiek AGCGA quadruplexen herkennen. De nanobody-AGCGA-quadruplex interacties zullen bestudeerd worden in termen van affiniteit, specificiteit, selectiviteit, en structurele aspecten van herkenning, wat zal leiden tot een set van goed gekarakteriseerde reagentia voor AGCGA-quadruplex detectie. Uiteindelijk zullen deze nanobodies gebruikt worden voor de detectie van AGCGA-quadruplex in cellen door middel van immunoimaging technieken. Parallel hiermee stellen we voor om de stabiliteit van AGCGA-quadruplex in vitro te onderzoeken met behulp van biofysische technieken om te bepalen hoe oplossingscondities (kationconcentratie, wateractiviteit, moleculaire verplaatsing) de stabiliteit beïnvloeden. Dit zal de resultaten van de in vivo studies bevestigen en een aanvullende benadering bieden om te beoordelen of AGCGA-quadruplexen stabiel zijn in vivo. De vaststelling van het mogelijke bestaan van een nieuw type niet-canonieke DNA structuur zal een sterke impuls geven aan het veld van de niet-canonieke DNA biologie, terwijl de ontwikkeling van AGCGA quadruplex-specifieke antilichamen de wetenschappelijke gemeenschap nieuwe instrumenten zal aanreiken voor verder onderzoek.
Onlangs werd een nieuwe vouw van een niet-canonieke DNA-structuur ontdekt, AGCGA quadruplex genaamd. Op sequentieniveau houden deze structuren zich vast aan een herhaling van het AGCGA-motief. Op structureel niveau worden deze quadruplexen gestabiliseerd door G-A en G-C basenparen die GAGA- en GCGC-quadruplexen vormen. In tegenstelling tot G-quadruplexen worden deze structuren niet gestabiliseerd door specifieke kationbinding en zijn zij dus ongevoelig voor de aard van het kation. De bio-informatica studie heeft AGCGA quadruplex sequentiemotieven geïdentificeerd in meer dan 40 menselijke genen die geassocieerd worden met de regulatie van basale cellulaire processen, neurologische aandoeningen, kanker, en afwijkingen in bot- en kraakbeenontwikkeling, terwijl mutaties van de motieven in verband zijn gebracht met autisme.
Het hoofddoel van het voorgestelde project is te bepalen of AGCGA quadruplexen in vivo worden gevormd. Dit vereist de ontwikkeling van detectiemiddelen, specifieke liganden, die AGCGA quadruplexen herkennen in de cellulaire natieve context. Wij zijn van plan om een panel van nanobodies (enkel-keten kameelachtige antilichamen) te ontwikkelen die specifiek AGCGA quadruplexen herkennen. De nanobody-AGCGA-quadruplex interacties zullen bestudeerd worden in termen van affiniteit, specificiteit, selectiviteit, en structurele aspecten van herkenning, wat zal leiden tot een set van goed gekarakteriseerde reagentia voor AGCGA-quadruplex detectie. Uiteindelijk zullen deze nanobodies gebruikt worden voor de detectie van AGCGA-quadruplex in cellen door middel van immunoimaging technieken. Parallel hiermee stellen we voor om de stabiliteit van AGCGA-quadruplex in vitro te onderzoeken met behulp van biofysische technieken om te bepalen hoe oplossingscondities (kationconcentratie, wateractiviteit, moleculaire verplaatsing) de stabiliteit beïnvloeden. Dit zal de resultaten van de in vivo studies bevestigen en een aanvullende benadering bieden om te beoordelen of AGCGA-quadruplexen stabiel zijn in vivo. De vaststelling van het mogelijke bestaan van een nieuw type niet-canonieke DNA structuur zal een sterke impuls geven aan het veld van de niet-canonieke DNA biologie, terwijl de ontwikkeling van AGCGA quadruplex-specifieke antilichamen de wetenschappelijke gemeenschap nieuwe instrumenten zal aanreiken voor verder onderzoek.
Datum:1 okt 2021 → Heden
Trefwoorden:Structural Biology, Molecular biophysics, nanobody, non-canonical DNA, Quadruplex DNA, i-motif
Disciplines:Andere biologische wetenschappen niet elders geclassificeerd