DNA herstel als een mechanisme voor radioresistentie in hoofdhals plaveiselcelcarcinoom

Hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) kan zich ontwikkelen via twee belangrijke carcinogene routes, namelijk infectie met het humaan papillomavirus (HPV-positieve HNSCC) en het overmatige gebruik van alcohol en/of tabak (HPV-negatieve HNSCC). Tegenwoordig wordt twee derde van de patiënten met HNSCC in een gevorderd stadium gediagnosticeerd, mede door het gebrek aan symptomen in vroegere stadia. De huidige behandelingsoptie voor patiënten met gevorderde ziekte is de combinatie van radiotherapie (RT) met chemotherapie, met of zonder operatie en is onafhankelijk van de HPV status. De huidige behandelingsopties krijgen echter te maken met twee grote obstakels.

Eerst en vooral treedt er normale weefseltoxiciteit op met de huidige behandelingsopties. Orofaryngeale mucositis is een van de meest voorkomende acute nevenwerkingen, waardoor de therapiegetrouwheid en de levenskwaliteit sterk daalt. Hierdoor wordt de uitkomst na therapie beïnvloed. Een veelbelovende, niet-invasieve behandelingsoptie voor orofaryngeale mucositis is low-level lasertherapie (LLLT). LLLT heeft als belangrijkste voordelen de bevordering van de wondheling en verlichting van de pijn. Hierdoor kan de uitkomst van patiënten na behandeling verbeteren.

Als tweede obstakel krijgen tot 50% van de patiënten met een lokaal gevorderde ziekte te maken met een lokaal herval na de behandeling, met radioresistentie als een van de belangrijkste redenen. De onderliggende biologische mechanismen zijn nog niet volledig begrepen en de behandelingsopties voor deze patiënten zijn zeer gelimiteerd.

In deze thesis focussen we op deze twee problemen, we onderzoeken het effect van LLLT op HNSCC-cellijnen (Hoofdstuk III), en we onderzoeken de onderliggende mechanismen van radioresistentie in HNSCC-cellijnen, met een focus op de DNA damage response (DDR) (Hoofdstuk IV).

Hoofdstuk III           Biologische effecten van low-level lasertherapie in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom cellijnen

LLLT is een veelbelovende preventieve en behandelingsstrategie voor RT-geïnduceerde acute toxiciteit, meer specifiek voor orofaryngeale mucositis. LLLT kan cellulaire processen stimuleren, wat resulteert in de bevordering van de wondheling en verlichting van de pijn. Dit heeft een positief effect op de levenskwaliteit van patiënten en zorgt ervoor dat het behandelingsschema volgehouden kan worden. Door het stimuleren van cellulaire processen heeft LLLT als risico om ook kankercellen te stimuleren, aangezien de plaats van LLLT-applicatie vaak de primaire tumorsite omvat. Om deze reden onderzochten we het effect van LLLT op HNSCC-kankercellen en normale epitheliale amandelcellen, aangezien deze epitheliale cellen betrokken zijn in het wondhelingsproces.

Het effect van LLLT op proliferatie werd onderzocht door HNSCC-cellijnen en normale epitheliale amandelcellen bloot te stellen aan LLLT met energielevels van 1 en 2 J/cm². HNSCC-cellijnen vertoonden een verhoogde delingscapaciteit, terwijl er geen effect te zien was in normale epitheliale amandelcellen. Celcyclus verdeling, verhoogde waarden van mitotische figuren en een verhoogd percentage van Ki67, een delingsmerker, na LLLT-behandeling ondersteunen de verhoogde delingscapaciteit in HNSCC-cellen. Mitotische pathways PI3K en MAPK/ERK werden geactiveerd op een dosis afhankelijke manier na LLLT-behandeling in HNSCC-cellen, wat niet gedetecteerd werd in normale epitheliale amandelcellen.

In conclusie, we toonden aan dat LLLT de delingscapaciteit van HNSCC-cellen kon stimuleren op een dosis afhankelijke manier door het stimuleren van delingspathways. Dit is een indicatie dat LLLT met zeer veel voorzichtigheid gebruikt moet worden in de kliniek voor patiënten met HNSCC die behandeld worden met RT in combinatie met chemotherapie. Kankercellen die aanwezig zijn in het LLLT-applicatieveld kunnen ongewild blootgesteld en gestimuleerd worden.

Hoofdstuk IV           De rol van DDR in radioresistente hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom cellijnen

De aanwezigheid van radioresistentie in een tumor is een van de belangrijkste oorzaken van het optreden van een lokaal herval na behandeling. Verscheidene mechanismen zijn toegeschreven aan een mindere response op RT. Deze mechanismen zijn de aanwezigheid van hypoxie, de aanwezigheid van kankerstamcellen, mitogene pathways, de DDR en DNA-herstelcapaciteit en de ontwijking van celdood. De exacte onderliggende mechanismen van radioresistentie zijn nog niet volledig gekend, maar de DDR is een van belangrijke mechanismen die het effect van RT bepalen. Om deze reden focussen we op de rol van de DDR in radioresistentie in HNSCC.

Om herval van patiënten na te bootsen, ontwikkelden we radioresistente HNSCC-cellijnen door blootstelling van parentale HNSCC-cellijnen aan een gefractioneerd RT behandelingsschema. Radioresistente cellen werden gegenereerd van zowel HPV-positieve en HPV-negatieve HNSCC om beide groepen te omvatten. Twee radioresistente klonen werden geselecteerd voor HPV-positieve parentale cellijn SCC154 en twee klonen voor HPV-negatieve parentale cellijn SCC61.

HPV-positieve en HPV-negatieve klonen vertoonden een stijging in radioresistentie in vergelijking met hun parentale cellijn, wat ook gevalideerd werd in muismodellen. Verschillen in de betrokkenheid van de DDR werden gedetecteerd tussen HPV-positieve en HPV-negatieve radioresistente klonen. HPV-positieve radioresistente HNSCC vertoonden een verhoogde DNA herstelcapaciteit en sneller celcyclus herstel na bestraling vergeleken met hun parentale cellijn. HPV-negatieve radioresistente HNSCC vertoonden een lagere afhankelijkheid voor celcyclus checkpunt inhibitie voor hun overleving en een lagere genomische instabiliteit na RT, wat suggereert dat ze een hogere intrinsieke replicatie capaciteit hebben.

Mogelijke strategieën om RT-response van HPV-positieve en HPV-negatieve HNSCC te verbeteren werden onderzocht door middel van DDR-inhibitie. Specifieke inhibitoren voor de celcyclus, non-homologous end joining en base excision herstelmechanismen konden het radioresistente fenotype van HPV-positieve en HPV-negatieve radioresistente klonen terugdraaien. Inhibitie van de DDR lijkt daardoor een interessante strategie om de RT-response voor HPV-positieve en HPV-negatieve radioresistente HNSCC te verbeteren.

In conclusie, we konden succesvol HPV-positieve en HPV-negatieve radioresistente HNSCC-cellen genereren door middel van gefractioneerde bestraling. Verschillen in DDR werden ontdekt tussen HPV-positieve en HPV-negatieve radioresistente HNSCC. Inhibitie van de DDR in combinatie met RT kan als een mogelijk radiosensitisatie strategie gezien worden voor HPV-positieve en HPV-negatieve radioresistente HNSCC.