Cellulaire signalering van ondergistende brouwgist tijdens seriële heropstelling

Het doel van dit onderzoek is om de veranderingen in het proteoom van S. pastorianus aan te pakken die nodig zijn om een flocculatie fenotype te vertonen. Hiervoor zal het proteoom gekwantificeerd worden tijdens de fermentatie van bier en over verschillende cycli van het opnieuw pitchen. Sleutelkinases, gekenmerkt door een verandering van hun abundantie bij de komst van flocculatie, zullen verder onderzocht worden op een directe betrokkenheid bij flocculatie. Dit zal een nieuw en fundamenteel inzicht geven in de onderliggende flocculatie-signaleringsgebeurtenissen in S. pastorianus en zou een grote impact hebben op het begrijpen en beheersen van dit fenotype. Twee onderzoekshypothesen zullen worden onderzocht: 1. Veranderingen in flocculatiegedrag gedurende re-pitching-cycli zijn niet alleen te wijten aan veranderingen in het FLO1-gen, maar ook aan veranderde kinasecel-signalering. 2. Translocatie van FLO1 op chromosoom VIII in S. pastorianus plaatst flocculatie onder een andere reeks cellulaire controleroutes dan in S. cerevisiae. De volgende 5 werkpakketten worden daarom gedefinieerd om de doelstellingen te bereiken en de onderzoekshypothesen te valideren of te falsifiëren: 1. Proteoom van flocculatie-fenotype in S. pastorianus om betrokken sleutelkinases te identificeren Het doel van dit werkpakket is om veranderingen in het proteoom van S. pastorianus in de tijd tijdens fermentatie te kwantificeren. Dit zal inzicht geven in de belangrijkste eiwitten die tot expressie worden gebracht bij de komst van een flocculatiefenotype in vergelijking met eerdere stadia van fermentatie. Kinases met de meest dramatische verandering in overvloed zullen worden beschouwd als de belangrijkste bij het vaststellen van dit fenotype en zullen worden gevalideerd in werkpakket 3 en vervolgens functioneel gekarakteriseerd in werkpakket 4. Dit werkpakket zal de eerste multi-omics-benadering zijn die gebruikmaakt van proteoomonderzoek naar gistuitvlokking met een metabolomics-benadering die de karakterisering van gistfermentatiebijproducten en de fermentatieomgeving omvat. 2. 2. Proteoom van veranderd flocculatiegedrag bij S. pastorianus gedurende verschillende heropzetcycli S. pastorianus zal opnieuw gepit worden over verschillende fermentatiecycli totdat een veranderd flocculatiegedrag wordt waargenomen en ernstig gemanifesteerd. Proteoomanalyse zal worden gebruikt om geleidelijke veranderingen in eiwitexpressie te kwantificeren, die gecorreleerd zullen worden met flocculatiegedrag en celwandintegriteit. Verder zal sequencing van het FLO1-gen worden uitgevoerd om inzicht te krijgen in de bijdrage van een veranderd genotype. Kinases geïdentificeerd in werkpakket 1 evenals kinasen waarvan de abondantieveranderingen correleren met veranderd flocculatiegedrag zullen gevalideerd en functioneel gekarakteriseerd worden in werkpakket 5. Dit werkpakket zal het eerste zijn om de veranderingen in het proteoom vast te stellen gerelateerd aan veranderingen in flocculatiegedrag ten opzichte van re -pitching cycli. 3. Validatie van kinasen die mogelijk betrokken zijn bij flocculatie met behulp van aanvullende S. pastorianus- en S. cerevisiae-stammen Validatie in bijkomende stammen van S. pastorianus en S. cerevisiae zal bewijzen welke van de kinasen geïdentificeerd in werkpakket 1 stamspecifiek zijn. 'Universele' kinasen zullen worden getest op hun betrokkenheid bij flocculatie door genmodificatie tot een katalytisch inactieve vorm. Verder zullen de flocculatie-triggers (nutritioneel, omgevingsfactoren) die de respectievelijke kinase beïnvloeden, worden onderzocht met behulp van fenotypering met hoge doorvoer. De opname van S. cerevisiae zal onderzoekshypothese 2 valideren of falsifiëren en is het eerste onderzoek op een wereldwijd proteoombreed niveau om de verschillen in flocculatie-signalering tussen S. pastorianus en S. cerevisiae te onderzoeken. 4. Substraten van sleutelkinases die betrokken zijn bij flocculatie van S. pastorianus Substraten van de kinasen die zijn gevalideerd om op een niet-rekspecifieke manier betrokken te zijn bij flocculatie (zoals vastgelegd in werkpakket 3), zullen worden geïdentificeerd. In het kort zullen stammen die wild-type of katalytisch inactief kinase van witer tot expressie brengen, geproduceerd in werkpakket 3, worden gebruikt in een diepe fosfo-proteomics-workflow om de substraten van deze kinasen te identificeren en te valideren. Dit zal nieuw en belangrijk inzicht geven in de onderliggende cellulaire signaalroutes die leiden tot een flocculatie fenotype in S. pastorianus en, afhankelijk van de uitkomst van werkpakket 3, ook in S. cerevisiae. 5. Substraten van sleutelkinases die betrokken zijn bij veranderd flocculatiegedrag bij re-pitching Kinases vastgelegd in werkpakket 2 zullen genetisch gemodificeerd worden om uitgedrukt te worden als katalytisch inactieve vorm in S. pastorianus. De invloed van specifieke spanningsbronnen op het flocculatiegedrag zal worden onderzocht door middel van high-throughput fenotypering. Fosfo-proteomics zullen worden toegepast om kinase-substraten te identificeren. De resultaten van dit werkpakket zullen de moleculaire en cellulaire basis leggen voor veranderingen in het flocculatiegedrag van ondergistende brouwgist gedurende her-pitching-cycli. Dit zal het potentiële gebruik van deze substraten mogelijk maken als surrogaat uitlezing van het verwachte flocculatiegedrag, tot op heden worden in de industrie alleen richtlijnen voor hergebruik van gist op basis van observatiegegevens gebruikt.