In silico gestuurde ontwikkeling van XNA-verwerkende enzymen

Xenobiotische nucleïnezuren (XNA) zijn synthetische analogen van natuurlijke nucleïnezuren (DNA en RNA). Ze worden ontwikkeld voor toepassingen zoals therapeutica, diagnostica en alternatieve dragers van genetische informatie. Het hoofddoel van het promotieonderzoek betreft het ontwikkelen van een ‘gereedschapskist’ met enzymen voor XNA in moleculaire biologie die steunt op rationele inzichten.

In hoofdstuk 2 werd nagegaan of beschikbare computergestuurde algoritmen mogelijk toepasbaarheid zijn om DNA-bindende enzymen ook XNA-polymeren te doen aanvaarden. Het DNA-ligase van het Chlorella-virus (ChVLig) werd hiervoor gebruikt als testmodel.  Vanwege de lage uniformiteit tussen de resultaten, werden deze gecategoriseerd en vergeleken binnen elke cluster van algoritmen om zo een rationele eerste selectie te maken van mogelijke mutanten. Na het bepalen van de optimale omstandigheden om wildtype ligase en zijn varianten tot expressie te brengen, werden alle mutanten gescreend om hun activiteit om gebroken XNA-fragmenten te verbinden (ligeren). Hoewel er geen activiteit werd geobserveerd voor XNA-gemodificeerde fragmenten, benadrukten de gegenereerde resultaten het algemene belang van de structuur van het enzym in plaats van de aminozuursequentie ervan. Op basis van deze resultaten, werd geconcludeerd dat niet enkel de aminozuursamenstelling van het enzym maar ook de algemene structuur en dynamiek van het enzym-substraat complex cruciaal zijn de enzymactiviteit. Om dit te bestuderen is een betrouwbaar model voor dit complex noodzakelijk.

In hoofdstuk 3 werd een nieuwe computergestuurde methode ontwikkeld om betrouwbare modellen te genereren voor nucleïnezuren die centraal gebonden worden in torusvormige eiwitten. Deze benadering werd opnieuw toegepast op ChVLig, het testmodel dat ook in hoofdstuk 2 gebruikt werd. De in silico resultaten gaven aan dat een stabiel enzymcomplex met XNA slechts kon bekomen worden als de centrale holte in  torus werd vergroot met een extra aminozuur. De in vitro resultaten bevestigden dat de 189insG-mutant van ChVLig duidelijk de beoogde enzymwerking vertoont. Deze 189insG-mutant van ChVLig is een belangrijk nieuw hulpmiddel voor synthetische genetica die de synthese van langere XNA gen-fragmenten mogelijk maakt, als aanvulling van de ‘toolbox’ met bestaande XNA-polymerasen.

In hoofdstuk 4 werd de methode tot die stand kwam in hoofdstuk 3 ontwikkeld tot een publiek toegankelijk software-platform waar een model kan worden gegenereerd voor XNA gebonden aan om het even welk nucleinezuurbindende eiwit waarvan een pdb-structuur in complex met DNA of RNA beschikbaar is. Bovendien werd het concept verder uitgebreid om in silico mutatie-analyses uit te voeren om XNA binding te optimaliseren en de orthogonaliteit te bekomen die nodig is voor gebruik in xenobiologie (PREDICT). Samen met een nieuwe screeningstest voor het fragmenteren van nucleïnezuren bieden de eerste resultaten verkregen voor ligasen, endonuclease en polymerasen een stevig fundament voor de rationele ontwikkeling van XNA-verwerkende enzymen.