Tot op het bot: skelet weefsel als alternatieve matrix in forensische toxicologie

In de forensische toxicologie is het ons doel om met behulp van toxicologie, analytische chemie en farmacologie te assisteren in medische of gerechtelijke onderzoeken naar drugs intoxicaties. Dit doel kan samengevat worden in drie onderzoeksvragen. Zijn er drugs of alcohol detecteerbaar? In welke concentraties vinden we deze terug? En wat is het effect van deze concentraties op de situatie die zich voordeed? Om deze vragen te beantwoorden worden er analyses uitgevoerd op biologische matrices. Traditioneel wordt er gebruik gemaakt van bloed, urine en speeksel. Post-mortem onderzoek geeft ons ook de mogelijkheid om visceraal weefsel te analyseren zoals lever, nier enz. Naar de traditionele matrices zoals bloed en urine is reeds veel onderzoek gebeurd. Dit maakt het mogelijk om een inschatting te maken van het effect van de gevonden concentraties op de situatie. Soms zijn deze traditionele matrices echter niet beschikbaar. Door ontbinding van het lichaam verdwijnen deze biologische weefsels. Dan wordt er gekeken naar de alternatieve matrices. Onder alternatieve matrices vallen de weefsels die goed bestand zijn tegen putrefactie. In gevallen van extreme putrefactie wordt er vaak enkel haar, tanden, nagels en botweefsel teruggevonden. Naar deze alternatieve matrices is er echter nog maar weinig onderzoek gebeurd. Over skeletweefsel zoals bot en beenmerg is het minst geweten. Bij acute toediening in proefdieren kunnen drugs gedetecteerd en opgespoord worden in botweefsel. Maar onderzoek naar chronische dosering in proefdieren is nog een leemte in het onderzoeksveld. Daarnaast kunnen er nog enkele casestudies gevonden worden maar grotere studies naar post-mortem concentraties in botweefsel zijn volledig afwezig in de literatuur. Skeletweefsel bevat ook beenmerg. Beenmerg zit ingekapseld in het bot en is daar uitstekend beschermd tegen putrefactie of externe contaminatie. Ook over deze matrix kan er maar weinig onderzoek teruggevonden worden.

Dit doctoraal onderzoeksproject heeft als doel te onderzoeken of skeletweefsel gebruikt kan worden in de forensische toxicologie. Hierbij werd de klemtoon gelegd op detectie en kwantificatie van forensische relevante stoffen. In een eerste fase werden analytische methodes ontwikkeld op een LC-MS/MS-systeem. Deze methodes werden gebruikt om met behulp van een dierenmodel enkele fundamentele vragen over chronische dosering en skeletweefsel te beantwoorden. In een volgende fase werden deze analytische methodes toegepast op humane post-mortem cases. Een eerste doel was het ontwikkelen van een standard operating procedure. Op deze manier kon er uniform data verzameld worden zodat er een referentiedatabase kan aangelegd worden. Daarnaast was het 2e doel om meer inzicht te krijgen in de verhoudingen tussen bloed, weefsel en bot. Met behulp van deze referentiedatabase kunnen drug concentraties in skeletweefsel beter geïnterpreteerd worden tijdens toxicologisch onderzoek. Als laatste onderzoek topic werd getracht om de distributie van drugs meer gedetailleerd te detecteren en visualiseren met MALDI-MSI. Deze methode kan enkele fundamentele vragen beantwoorden over de eigenlijke drugs distributie in botweefsel.

In hoofdstuk één werd een LC-MSMS-methode geoptimaliseerd en volledig gevalideerd voor de detectie en kwantificatie van methadon en zijn metabolieten in botweefsel. Deze methode werd toegepast op een studie met behulp van een dierenmodel. Ratten werden gedurende een half jaar dagelijks gedoseerd met methadon. Na deze periode werden deze ratten ge-euthanaseerd. Botjes werden uit de rat gedissecteerd en geëxtraheerd met een methanol extractie. Vervolgens werd de distributie in een bot onderzocht. Trabeculair (=spongieus) botweefsel bleek hogere drug concentraties te bevatten dan compact botweefsel. Een mogelijke verklaring was de hogere vascularisatie graad van trabeculair botweefsel. Beenmerg bleek ook veel hogere concentraties te bevatten dan botweefsel. Daarnaast werd ook de drug distributie binnen het skelet geëvalueerd. Lange beenderen bleken hogere methadon concentraties te bevatten dan de korte en onregelmatige beenderen. Wanneer de concentraties tussen de verschillende ratten werden vergeleken, bleek er in de tibiae en humeri van de verschillende gelijk gedoseerde ratten eenzelfde methadon concentratie te zitten. Voor de metabolieten werd er geen correlatie gevonden.

In hoofdstuk twee werd een LC-MS/MS-methode geoptimaliseerd en volledig gevalideerd voor de detectie en kwantificatie van citalopram, clomipramine, midazolam en de overeenkomstige metabolieten. Wederom werd deze methode toegepast op een studie met behulp van een rattenmodel. Ratten werden gedurende een half jaar gedoseerd met citalopram, clomipramine of midazolam. Vervolgens werden deze dieren geëuthanaseerd en ontbeend. Deze beenderen werden geanalyseerd met de gevalideerde methode. Citalopram, clomipramine en hun metabolieten werden gedetecteerd en gekwantificeerd in alle botten en bloed. Midazolam bleek noch in bot noch in bloed detecteerbaar. Een mogelijke verklaring kan zijn dat drugs die niet meer aanwezig zijn in bloed, ook niet aanwezig zijn in botweefsel. Een andere mogelijke verklaring was dat de concentraties onder onze limiet van detectie lagen. Deze laatste verklaring is echter weinig waarschijnlijk vermits geen chronische steady state concentratie was bereikt. Vervolgens werden de concentraties in de botten van één rat met elkaar vergeleken. In overeenstemming met onze vorige bevindingen bleken lange beenderen een hogere drug concentratie te bevatten. Wanneer de concentraties in de botten tussen de ratten werden vergeleken kon er echter geen correlatie gevonden worden zoals in hoofdstuk 1. De drug-metaboliet ratio bleek echter wel zeer constant te zijn in de botten van één dezelfde rat en in overeenstemming met de ratio in bloed. Deze ratio kan dus mogelijk van grote waarde zijn in toxicologisch onderzoek.

In hoofdstuk drie, werden de methodes van hoofdstuk één en twee volledig gevalideerd voor beenmerg. Vervolgens werden deze methodes toegepast op forensische post-mortem cases. In een eerste fase werd de efficiëntie om 415 forensische componenten te detecteren in post-mortem bloed, botweefsel en beenmerg met elkaar vergeleken. Zowel botweefsel als beenmerg bleken een goed alternatief voor het traditionele bloed. In 80,5% van de positieve gevallen in bloed, bleek beenmerg ook positief. In een tweede fase werden citalopram, clomipramine en methadon gekwantificeerd in beenmerg, botweefsel en bloed. Beenmerg bleek over het algemeen de hoogste concentraties te bevatten van methadon, citalopram en clomipramine. Wanneer deze concentraties met elkaar gecorreleerd werden, bleek er een duidelijk lineair verband tussen de citalopram bot concentratie en de bloedconcentratie. Hetzelfde lineair verband was aanwezig tussen citalopram beenmerg concentratie en bloedconcentratie. Wanneer de methadon bot concentratie werd gecorreleerd met de bloedconcentratie, dan was er wederom een lineair verband. De correlatie van beenmerg methadon concentratie met bloedconcentratie toonde ons een exponentieel verband.

Hoofdstuk vier is een verderzetting van hoofdstuk drie. Een nieuwe LC-MS/MS-methode voor het detecteren en kwantificeren van zes narcotica werd geoptimaliseerd en volledig gevalideerd voor botweefsel en beenmerg. Deze methode werd toegepast voor de analyse van 22 forensische zaken. Ieder van de 6 narcotica kon gedetecteerd en gekwantificeerd worden. Voor zo ver als de auteur weet, is dit de eerste keer dat er post-mortem bot en beenmerg concentraties worden bepaald voor fentanyl en norfentanyl. Het aantal cases was echter te laag om conclusies te trekken over correlatie. Wanneer we tramadol bot concentraties correleren met bloedconcentraties dan was er een lineaire trend. Dezelfde lineaire correlatie was zichtbaar tussen beenmerg en bloedconcentraties. Voor codeïne zagen we wederom dezelfde lineaire trend tussen bot, beenmerg en bloedconcentraties. Wanneer morfine bloedconcentraties werden gecorreleerd met bot of beenmerg concentraties was er geen trend zichtbaar. Dit kan verklaard worden door de grote verschillen in metabolisme tussen verschillende personen. Ondanks dat er enkele uitzonderingen op de lineaire trend zijn (bv. extreme overdosissen), tonen deze resultaten het grote potentieel van skeletweefsel als alternatieve matrix.

Hoofdstuk vijf behandelt een nieuwe methode voor het detecteren en visualiseren van drugs in skeletweefsel met behulp van massaspectrometrie imaging. Een volledig nieuwe staalvoorbereiding werd ontwikkeld en geoptimaliseerd. Dit protocol werd toegepast om de aanwezigheid van methadon en EDDP te visualiseren en detecteren in dezelfde ratten als hoofdstuk 1 en een mensen bot uit hoofdstuk 3. Daarnaast werd de methode verder geoptimaliseerd voor detectie van lipiden. Deze nieuw ontwikkelde methode opent de deur naar toekomstige toepassingen in de forensische als in de (pre)klinische wereld.