Het effect van omgevingstemperatuur op de ontwikkeling van Brachypodium distachyon en mRNA bindende eiwitten in bloemplanten

Er wordt voorspeld dat de mondiale temperatuur tegen het einde van deze eeuw met 1,8 °C tot 4 °C zal stijgen. Deze kleine verandering in temperatuur kan de oogst met gemiddeld 4% verminderen. Daarom is het belangrijk om te weten hoe gewassen reageren op deze kleine temperatuurverandering om de impact op de opbrengst van gewassen te voorspellen. Plantenonderzoek op basis van de modelplant Arabidopsis thaliana heeft onze kennis van moleculaire biologie in planten verbreed, maar Arabidopsis heeft beperkingen wanneer het wordt gebruikt als een model voor de grassen uit gematigde streken wanneer men grasspecifieke kenmerken wil onderzoeken. Brachypodium distachyon is een model geworden voor grassen zoals tarwe en gerst vanwege het kleinere genoom, relatief gemakkelijk te manipuleren in het laboratorium en beschikbare mutanten. Daarom hebben we in dit werk Brachypodium distachyon gebruikt als een model om de temperatuurseffecten op de ontwikkeling van planten te onderzoeken.

Ten eerste hebben we de originele klimaatgegevens verzameld van vijf Brachypodium distachyon-accessies, inclusief facultatieve accessions en winter-accessies. Op basis van de oorspronkelijke klimaatinformatie van verschillende accessies, groeiden we vijf verschillende Brachyopdium distachyon accessies bij 14 °C, 18 °C en 22 °C om de effecten van de omgevingstemperatuur op Brachypodium distachyon accessies te verkennen. De bloeitijd, blad- en vertakkingen tijdens de bloei, zaadmaturatieperiode, zaadgewicht en -grootte en dormantie werden geregistreerd. We hebben aangetoond dat de zaadontwikkelingsfase gevoeliger is voor de veranderende temperatuur dan de bloeitijd, en zaadgewicht is negatief gecorreleerd met verhoogde temperaturen.

Ten tweede zijn FLOWERING LOCUS C (FLC), het paraloog FLOWERING LOCUS M (FLM) en ook SHORT VEGETATIEVE PHASE (SVP) belangrijke bloeirepressoren in de omgevingstemperatuur regulatiewegen in de modelplant Arabidopsis thaliana. De homologen van FLC en SVP zijn onderzocht in monocots, maar of ze betrokken zijn bij de omgevingstemperatuur van monocots is nog onduidelijk. In Brachypodium distachyon zijn BdODDSOC1, BdODDSOC2 en MADS37 geïdentificeerd als FLC-homologen en VEGETATIVEREPRODUCTIVE TRANSITION gen 2 (BdVRT2), MADS1 (BdBM1) en MADS10 (BdBM10) zijn geïdentificeerd als SVP-homologen. Gebaseerd op de mutantlijnen van FLC-homologen en SVP-homologen in Brachypodium distachyon, hebben we deze mutantlijnen fenotypisch onderzocht bij verschillende temperatuuromstandigheden. De resultaten toonden aan dat er geen verschil in bloeitijd in de mutantlijnen van FLC-homologen werd waargenomen, maar we vonden dat één mutant van de SVP-homologen in Brachypodium distachyon, BdVRT2 T-DNA-lijn (verlies van functie) tragere bloei bij hogere omgevingstemperatuur. Daarom kan BdVRT2 een bloeipromotor zijn in Brachypodium distachyon.

Ten derde hebben we, om de functie van BdVRT2 in bloei te begrijpen, de BdVRT2 genfunctie onderzocht op basis van de BdVRT2 T-DNA-mutantlijn in Brachypodium distachyon. We vonden dat BdVRT2 tijdens de koudebehandeling wordt opgereguleerd en dat in de T-DNA-mutantlijn de bloei in gevernaliseerde toestand vertraagde. Dit gaf aan dat BdVRT2 de overgang naar bloei in vernalisatie bevordert. Bovendien vertoonde BdVRT2 vergelijkbare expressiepatronen als de belangrijkste bloeipromotor VERNALISATIE 1 (BdVRN1). De interactie van BdVRT2 en BdVRN1 werd aangetoond door middel van yeast-two-hybrid assay, GST pull-down assay en bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) in mesofylprotoplasten uit bladeren.

Ten vierde was een zijproject het onderzoeken van de mogelijke functie van een van de FLC-homologen, BdODDSOC1, in Brachypodium distachyon. De mutantlijnen werden in verschillende omstandigheden gefenotypeerd in een combinatie van daglengte en vernalisatie, maar er is geen interessant fenotype gevonden, behalve een klein verschil in bladaantal tijdens de bloei. De bladontwikkeling onder dezelfde omstandigheden werd gefenotypeerd en de mutantlijn van het BdODDSOC1 T-DNA vertoonde een hogere snelheid van bladontwikkeling. Het lijkt erop dat de enkele functie van BdODDSOC1 in de bladontwikkeling gering is. Het vriestolerantie-experiment werd getest op overlevingspercentage van BdODDSOC1 T-DNA en WT bij koude temperatuur, wat werd geïnterpreteerd als een mogelijke rol van BdODDSOC1 om de zaailingen tegen vorststress te beschermen.

Het laatste project dat ik deed was om de RNA-bindende eiwitten (RBP's) te identificeren met een gemodificeerde RNA-interactome methode in Brachypodium distachyon. Deze methode werd met succes toegepast op Brachypodium scheut- en bladmesofylprotoplasten en we identificeerden in totaal 405 RBP's. We hebben geprobeerd de geïdentificeerde RBP's in vivo te valideren op basis van de commerciële silicakolommen, die de RNA-eiwitcomplexen in de filter kunnen vasthouden. Na de silicakolommen worden de RNA-eiwitcomplexen behandeld met RNase en kunnen de doeleiwitten op het western-blotmembraan worden gevisualiseerd. Hoewel de input van doel-RBP konden worden gezien op het western-blotmembraan, werd de output van de silicakolomstalen niet gezien op het western-blotmembraan. Daarom moet de validatiemethode voor RBP's met hoge doorvoer naar de toekomst worden gewijzigd.

Concluderend geven de resultaten aan dat het voortplantingsstadium in de ontwikkeling van Brachypodium distachyon gevoeliger is voor omgevings temperatuur dan het bloeitransitie stadium. We toonden aan dat BdVRT2 een bloeipromotor is in vernalisatieregulatie. Daarnaast hebben we 405 RBP’s geïdentificeerd in Brachypodium distachyon stengel en blad mesophyll protoplasten en hebben we gewezen op de beperking van de RNA interactome capture methode.