< Terug naar vorige pagina

Project

Een rational drug design voor de aanpak van nieuwe Thy-X remmers voor de behandeling van tuberculose

Part 1: 

Tuberculose (TB) is een besmettelijke ziekte die veroorzaakt wordt door Bacillus Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis). Deze ziekte wordt beschouwd als de belangrijkste doodsoorzaak die veroorzaakt wordt door één enkele besmettelijke agens, zelfs voor HIV/AIDS. Het aantal tuberculosegevallen is de afgelopen twintig jaar nagenoeg niet afgenomen De infectieziekte treft elk jaar nog steeds 10 miljoen mensen en is niet onder controle in verschillende delen van Afrika en Azië. De belangrijkste bedreiging van TB is de toename infecties door multiresistente (MDR) en extensief-resistente (XDR) stammen. Meer dan 20% van de wereldwijde gevallen van TB wordt geschat resistent te zijn voor ten minste één eerste lijns- tuberculosegeneesmiddel. MDR-TB (resistentie tegen de krachtigste eerstelijnsgeneesmiddelen isoaniazid en rifampicine) noopt tot de overschakeling op tweedelijnsmedicijnen die minder effectief zijn en gevaarlijkere bijwerkingen en hogere kosten met zich meedragen. XDR-TB (MDR-TB plus resistentie tegen fluoroquinolonen en tweedelijns injecteerbaar geneesmiddelen) duidt op het falen van de gestandaardiseerde tweedelijnsbehandelingen. Door inefficiënt en inadequaat geneesmiddelengebruik ontstonden TB-endemische landen ongeneeslijke resistente stammen met totale resistentie tegen de beschikbare geneesmiddelen. In vier landen, Italië, Iran, India en Zuid-Afrika werden gevallen vastgesteld van volledig resistente TB (gedefinieerd als TB veroorzaakt door stammendie niet reageren op alle bestaande eerstelijns- en tweedelijnsgeneesmiddelen). Geneesmiddelenresistente TB gaat gepaard met hoge morbiditeit en mortaliteit en is erg duur om te behandelen. Verworven resistentie, d.w.z. de ontwikkeling van resistentie tijdens de behandeling, is de belangrijkste oorzaak van resistentiegevallen. Dit wordt gedeeltelijk veroorzaakt door slechte naleving van de behandeling tijdens de langdurige behandelingskuur, en door de ernstige bijwerkingen. Een aantal geneesmiddelen zit nu in de pijplijn. Veel geneesmiddelen bevinden zich echter in de preklinische of klinische ontwikkelingsfase. Enkel bedaquiline en delamanid zijn voorhanden voor klinisch gebruik voor deze vorm van TB. Deze geneesmiddelen worden echter beschouwd als laatste-redding antibiotica vanwege onvolledige informatie m.b.t. hun veiligheid. Bij beide geneesmiddelen werden ondertussen ook gevallen van verworven resistentie vastgesteld.

 

Een eerste doel van dit doctoraatsproject richt zich op de ontwikkeling van nieuwe anti-mycobacteriële geneesmiddelen met een nieuw werkingsmechanisme dat Mycobacteriumselectief inhibeert. De endogene synthese van de DNA bouwsteen dTMP uitgaande van dUMP werd hiervoor geselecteerd.

 

Eukaryote organismen zoals de mens en vele andere organismen, dragen de genen voor thymidylaatsynthase A (ThyA). Dit enzym gebruikt CH2THF als de koolstof- en hydridebron voor de productie van dTMP uit dUMP. Diverse pathogenen waaronder Mycobacteria dragen echter genen voor een andere klasse van thymidylaatsynthasen (TS), bekend als thymidylaatsynthase X (ThyX). De complexe verschillen tussen beide TS, zoals het type en het aantal reactietussenproducten, substraatactiveringen of methyleenoverdrachten, zouden het ontwerp van selectieve remmers van ThyX moeten vergemakkelijken. Dit wordt verder ondersteund door de afwezigheid van een sequentiële of structurele homologie tussen de twee TS.

 

  ThyX katalyseert de reductieve methylatie van 2'-deoxyuridine 5'-monofosfaat (dUMP) tot 2'-deoxythymidine-5'-monofosfaat (dTMP) met methyleentetrahydroflaat (CH2THF) als de methyleenbron (CH2) en het NADPH/FAD-systeem als de bron van hydride (H). Voor diverse pathogenen waaronder mycobacteria, is die een levensnoodzakelijke katalytische stap voor de novo synthese van dTMP dat endogeen moet worden aangemaakt voor hun DNA synthese en herstel

 

Genomische studies toonden aan dat Mycobacteriabehoort tot de weinige organismen die de genen draagt voor zowel ThyA als ThyX, waardoor de vraag naar de ware biologische rol van beide enzymen zich stelt. In verschillende onderzoeken werd ThyX echter geïdentificeerd als het essentiële gen voor M. tuberculosis.

 

In deze doctoraatsthesis willen we selectieve M. tuberculosisThyX-remmers identificeren door de ontwikkeling van een biochemische test die geschikt is voor high-throughput screening (HTS) (Hoofdstuk II). De test controleert de NADPH tot NADP+oxidatiestap aan de hand van een op absorptie gebaseerde uitlezing. We beschrijven eerst de ontwikkeling en optmalisatie van deze test door de aanpassing van testomstandigheden (CH2THF, dUMP, NADPH en ThyX concentraties) gevolgd door testvalidatie, gebruikmakend van dUMP-substraatanalogen. IC50-waarden die vergelijkbaar zijn met degevestigde radioactieve tests (opvolgen van productvorming met behulp van [5-3H]-dUMP) werden verkregen. Vervolgens concentreren we ons op de factoren die essentieel zijn voor de haalbaarheid van HTS. Deze omvatten de selectie van 50 μM foliumzuur als referentie voor de inhibitie, stabiliteit van de test (zowel signaal- als enzymactiviteit) tot 60 minuten bij kamertemperatuur, en testcompatibiliteit met DMSO. Ten slotte beschrijven we de resultaten van de HTS uitgevoerd op 40.000 producten in samenwerking met Cistim. Doorheen de test werd een Z'-waarde > 0.5 gehandhaafd, wat wijst op een hoge testkwaliteit en robuustheid. We identificeerden 14 verbindingen, waarvan er 7 (uit verschillende chemische klassen) verder werden getest op de inhibitie van M. tuberculosisThyA. De 7 verbindingen waren selectief voor ThyX. De beste remmer had een matige IC50van 710 nM en werd verder geëvalueerd aan de hand van kinetische experimenten om het werkingmechanisme te begrijpen.

 

 Part 2: 

Nucleïnezuren (DNA en RNA) zijn fundamentele biopolymeren die instaan voor de opslag, overdracht en expressie van genetische informatie.  Bovendien kan hunenkelstrengige vorm opouwen in een driedimensionale structuur met een specifieke biologische functie zoals een rechtreekse katalyse van biochemische reacties of regulerende functie via binding aan een specifiek doelwit. Deze eigenschappen, in combinatie met relatief makkelijke  manipuleerbaarheid en de beschikbaarheid van verschillende DNA/RNA-modificerende enzymen zorgt voor een grote belangstelling voor de toepassing van nucleïnezuren met nieuwe activiteiten. 

 

In de drie onderdelen van nucleotide-bouwstenen (base, suiker of fosfaat eenheid) kunnen modificates worden aangebracht die zorgen voor een verbetering van de stabiliteit of een verbetering van de activiteit van gemodificeerde nucleïnezuren. Basen kunnen gewijzigd worden door het inbrengen van functionele chemische groepen zoals fluorescente kleurstoffen. Substituties van basen in nucleïnezuren kunnen worden gebruikt voor het maskeren van restrictieplaatsen die creatie van stabiele genetische templates mogelijk maken om de gewenste informatie of functie (een dergelijke inhibitie van eiwitten) in vivote introduceren. Bovendien kunnen synthetische genetische polymeren met alternatieve nucleobasen worden gebruikt om eiwitten te ontwerpen met niet-natuurlijke aminozuren via een nieuwe genetische code. 

 

In het tweede deel van deze thesis evalueren we nucleobase-analogen voor hun baseparing, DNA-polymeraseherkenning en selectiviteit. In Hoofdstuk V, onderzoeken we de 8-aza-dG (GN1) en 8-aza 9-deaza-dG (GN2) gekoppeld aan de deoxyribosesuiker via de N8. Bij het zoeken naar de beste basepaarcombinaties werden ze getest op paring met 1)8-gesubstitueerd N9-geglycosyleerd hypoxanthine [8-amino-dI (Hx1), 1-methyl 8-amino-dI (Hx2) en 8-oxo -dI (Hx3)] of 2)het pyrimidine, 5-methyl deoxyisocytidine (d-isoCMe). We hebben waargenomen dat kleine structurele veranderingen zoals de N9in GNXof de 1-methylgroep in HxXeen significant effect kunnen hebben op de opnamecapaciteit en selectiviteit van DNA polymerasen. Het meest efficiënte herkenbare basepaar was de GN2:isoCMegevolgd door GN1- of GN2-koppeling met Hx1of Hx2. In termen van selectiviteit waren de beste baseparen GN1:isoCMegevolgd door GN1:Hx2. De laatste purine:purinecombinatie toont de vorming van een Hoogsteen-basenpaar op polymerase-niveau aan omdat de 1-methylgroep van Hx2de Watson-crick-kant van de paring blokkeert. Verder laten we zien dat GN2met zichzelf een complementair basenpaar kan vormen. De enzymatische biocompatibiliteit van baseparen bestaande uit N8-gekoppelde purine met een Hoogsteen basepaar herkenningssysteem zou de ontwikkeling van baseparen die zich verwijderen van de chemie van het natuurlijke systeem moeten bevorderen.

 

Modificatie van de suikereenheid kan worden gebruikt om nuclease-resistente biopolymeren te creëren voor de ontwikkeling van therapeutische nucleïnezuren. In combinatie met base-analogen kunnen ze de vorming ondersteunen van een orthogonaal genetisch systeem dat kan worden gebruikt in het ontwikkelen van veilige genetisch gemodificeerde organismen. InHoofdstuk VIbestuderen we hexitol nucleïnezuren (HNA) in combinatie met het isoguanine (isoG): 5-methyl-isocytosine (isoCMe) basenpaar om de vraag te beantwoorden naar de invloed van suikerchemie op de basenparing door metingen van duplexstabiliteit en in vitroen in vivoenzymatische herkenning. De in vitroDNA-polymerase-experimenten tonen aan dat HNA-afhankelijke HNA-synthese (van een isoG: isoCMe-basenpaar) van slechts twee nucleotiden mogelijk is. Wanneer een DNA-ruggengraat werd ingebouwd, werden isoG tegen 3 d-isoCMe-nucleotiden in de template (of isoCMetegen isoG-templaternucleotiden) waargenomen. In overeenstemming met de in vitroen in vivoexperimenten werd isoG voornamelijk herkend door dT, terwijl isoCMevoornamelijk werd herkend door dA. De in vitro-incorporatie-experimenten toonden aan dat HNA een variabel effect op de selectiviteit had (polymerase-afhankelijk effect). In vivowas de herkenning van hexitol-nucleosiden van isoG en isoCMedoor het natuurlijke systeem echter aanzienlijk lager dan de deoxyribose-nucleosiden. Dit wijst ons naar de volgende stappen die genomen moeten worden voor de ontwikkeling van een op HNA gebaseerd orthogonaal genetisch informatiesysteem.

 

Datum:1 okt 2011 →  13 sep 2019
Trefwoorden:antimycobacterial, artifical nucleic acid
Disciplines:Ontdekking en evaluatie van geneesmiddelen
Project type:PhD project