PhD Yuan Biao

De Type III-eiwitsecretie (T3S) systeem komt veel voor bij Gram-negatieve pathogenen, zoals enteropathogene E. coli(EPEC). EPEC kan de T3S-machine, ook wel injectisoom genoemd, gebruiken om virulentiefactoren in de gastheercel af te leveren. Het injectiesysteem bestaat uit het basale lichaam met een naar het cytoplasma gekeerde exportapparaatkanaal en een aan het oppervlak blootgestelde naald gericht naar de gastheercel. Het exportapparaat omvat een conisch SctR5S4T1-exportkanaal, versierd door SctU en omgeven door SctV. Het grote cytoplasmatische domein (C-domein) of SctV bindt T3S chaperone/substraatcomplexen en vormt een vermoedelijke voorkamer die leidt naar de membraantranslocase. Het doel van deze studie is om de assemblage van het exportapparaat en het mechanisme van door Ca2+gemedieerde substraatomschakeling te ontleden.

Dissectie van EPEC T3SS en bepaling van de structuur ervan worden gehinderd door het lage aantal injectisomen per cel. Ten eerste melden we dat de plasmide dat codeert voor regulator Per en de hoofdregulator Ler kunnen de productie van het injectisomen 2-3 keer verbeteren. Dat suggereert dat het mogelijk is om de productie van het injectisoom te maximaliseren voor verdere biochemische en biofysische analyse van de T3SS in vitro.

SctW is van cruciaal belang bij het regelen van substraatomschakeling van translocators naar effectors en Ca2+. In deze studie willen we de connectie tussen Ca2+en SctW gerelateerde substraatomschakeling in EPEC achterhalen. De geoptimaliseerde M9 medium is geoptimaliseerd en wordt gebruikt vanwege zijn lagere complexiteit en gemakkelijkere manipulatie. Waargenomen SctW-secretie en effectorsecretie vallen niet samen, hetgeen de hypothese ontkracht dat secretie van SctW effectorsecretie initieert. Bovendien veranderde Ca2+de SctW-membraanassociatie niet, wat aangeeft dat SctW de effectorsecretie activeert zonder los te komen van het membraan.

Om het mechanisme van assemblage en functie van het T3S-exportapparaat te onderzoeken, hebben we eerst live cell imaging gebruikt. SctV assembleert in oligomere clusters aan celperiferie van zowel EPEC als een niet-T3SS E.coli-stam. Niet-ionogene detergenten extraheren SctV homo-nonameren uit membranen van beide stammen. De gereconstitueerde His-SctV9-PR-peptidiscs vertonen een langwerpig, tripartiet deeltje van ~22 nm met een membraandomein en een smalle linker die is verbonden met een C-domein. Het C-domein assembleert in een holle asymmetrische ring met een inwendige opening van 5-6 nm. SctV9is noodzakelijk en voldoende als receptor voor chaperone/substraatcomplexen via zijn C-domein. Deze bevindingen ontkoppelen mechanisch het chaperone/substraat-targeten van de volgende translocatiestap en bevorderen het structurele begrip van de injectie-assemblage.