< Terug naar vorige pagina
Project
Chromosomale afwijkingen in menselijke preimplantatie embryo's en embryonale stamcellen: oorzaken, mechanismen en gevolgen voor in vitro fertilisatie en regeneratieve geneeskunde. (FWOAL535)
Verschillende studies melden dat 40 tot 70 % van de menselijke preimplantatie embryo's chromosomale abnormaliteiten vertonen (Fauser, 2008). De meeste van deze afwijkingen werden gevonden in embryo's die werden gebiopsieerd, waarna de gebiopsieerde cellen werden geanalyseerd door middel van FISH met een maximum van negen chromosomen, tijdens een IVF cyclus met preimplantatie genetische screening (PGS). PGS wordt toegepast bij IVF patiënten met een slechte prognose om IVF resultaten te verbeteren.
Hoewel de aangetroffen aneuploidieën wellicht de meest belangrijke factor zijn met een invloed op de implantatie van het embryo in de uterus, is het niet duidelijk in welke mate deze abnormaliteiten een rol spelen.
Ten eerste, zouden het aantal aangetroffen aneuploidieën een lagere verhouding van geïmplanteerde embryo's voorspellen na transfer, and ten tweede heeft de aanwezigheid van mosaicisme ertoe geleid dat een aantal onderzoekers vermoeden dat sommige aneuploidieën en het mosaicisme op latere stadia van het embryo worden gecorrigeerd, mogelijk door ofwel door selectieve migratie van abnormale cellen naar de trophectoderm of door apoptose. Deze factoren zouden kunnen uitleggen waarom PGS er niet in is geslaagd om het aantal zwangerschappen na IVF te verhogen, als aangetoond door onze eigen groep (Staessen et al., 2004 en 2008) en door anderen (Twisk et al., 2006). Daarentegen is er weinig geweten op het cellulair niveau over hoe deze afwijkingen ontstaan, hoe ze zichzelf corrigeren, en wat hun invloed op de ontwikkeling van het embryo is.
Menselijke embryonale stamcellen (hESC) worden afgeleid uit preimplantatie embryo's, en vormen een grote belofte op het gebied van regeneratieve geneeskunde omdat ze zich kunnen ontwikkelen naar om het even welk celtype in het volwassen menselijk lichaam. De laatste jaren werd door intensief onderzoek een aantal protocollen ontwikkeld voor de differentiatie van hESC naar volwassen celtypes (vb insuline-producerende cellen, Kroon et al., 2008). Op dit ogenblik bestaat er een zekere bezorgdheid omtrent de genomische instabiliteit van hESC tijdens in vitro cultuur. Wij (Spits et al., 2008) en anderen (Baker et al., 2007) hebben aangetoond dat hESC de neiging hebben om chromosomale abnormaliteiten te ontwikkelen, zoals aneuploidieën, uitdrukking van fragiele sites en kleine duplicaties met een hotspot op 20q21.11.
Deze genomische instabiliteit doet erg denken aan het gedrag van kankercellen, en veroorzaakt grote bezorgdheid omtrent het gebruik van hESC voor therapeutische doeleinden en als betrouwbaar onderzoeksmodel. Desondanks is ook hier weinig geweten over de ontstaansmechanismen van en de invloed van de cultuuromstandigheden op deze afwijkingen.
Onze hypothese is dat menselijke embryo's en stamcellen een celcyclus hebben die verschillend is van somatische cellen wat betreft de checkpunten, en dat dit de gevoeligheid van deze cellen voor chromosomale afwijkingen uitlegt.
De eukaryote cel vertoont vier checkpunten: het start checkpunt in de late G1 fase, het S fase checkpunt, het G2 naar M checkpunt en het spindle attachment checkpunt (SAC) gedurende de metafase naar anafase overgang.
Het eerste checkpunt beslist of de cel zal starten met replicatie van de chromosomen, en zal de celdeling stoppen in G1 wanneer het DNA beschadigd is, maar ook in geval van contact inhibitie, tekort aan groeifactoren en replicatieve veroudering. Het intra-S checkpunt checkt of er beschadigd DNA aanwezig is, en of de DNA replicatie is voltooid, door vb te zoeken naar replication forks. De rol van het G2 naar M checkpunt is voornamelijk het nakijken van DNA beschadiging gebruikmakende van een pathway die sterk op het G1 checkpunt lijkt. Tenslotte gaat het SAC na of alle centromeren correct gehecht zijn aan de mitotische spoelfiguur.
De verschillend checkpunten staan onder controle van grote proteïne complexen en cascades voor activatie, inductie en gecontroleerde degradatie. In de meeste cellen zal arrest door langdurige checkpunt activatie leiden tot apoptose. Daarentegen werd gerapporteerd dat embryonale stamcellen (ESC) van de meeste species in staat zijn om deze apoptose te vermijden door het checkpunt te negeren (Syljuasen, 2007), door het checkpunt los te koppelen, of door een inactief checkpunt. G1 checkpunt ontkoppeling werd gevonden in ESC van de resusaap (Fluckiger et al., 2006), de muis (Aladjem et al., 1998) en de mens (Qin et al., 2007).
Het G2 checkpunt is nog niet in detail bestudeerd in stamcellen, hoewel de resultaten van Chuykin et al. (2008) in de muis suggereren dat het detectie systeem voor beschadigd DNA actief is in deze cellen. Het SAC is actief in mESC, maar er werd aangetoond dat de cellen in staat zijn om aan arrest te ontsnappen en apoptose te vermijden (Mantel et al., 2007). Het lijkt er op dat alle checkpunten volledig actief worden en dus ook in staat zijn om apoptose te induceren wanneer stamcellen gaan differentiëren.
Daartegenover staat dat de cel cyclus controle in menselijke preimplantatie embryo's grotendeels onbekend terrein is. Het frequente voorkomen van aneuploidieën in menselijke embryo's lijkt er op te wijzen dat embryo's geen SAC hebben of dat ze checkpunt adaptatie ondergaan.
HESC worden afgeleid van de kiemknop van preimplantatie embryo's, en worden dikwijls beschreven als een goed model voor het onderzoek naar vroege menselijke ontwikkeling. Onze hypothese is dat de drie celcyclus checkpunten inactief zijn gedurende vroege menselijke preimplantatie ontwikkeling, mogelijk enkel gedurende de klievingstadia, of misschien enkel vóór de activatie van het embryonaal genoom op het vier-tot-achtcellig stadium (Caufmann et al., 2006). Het SAC zou het eerste volledig functionele checkpunt zijn (mogelijk in de late klievingstadia of in het blastocyststadium, waardoor zelfcorrectie in blastocysten zou kunnen worden uitgelegd) en de twee andere checkpunten zouden later in de ontwikkeling geactiveerd worden naargelang de differentiatie van de cellen en in analogie met hESC, waar men weet dat minstens één checkpunt (het G1) volledig functioneel is in gedifferentieerde maar niet in ongedifferentieerde cellen.
De doelen van dit project zijn:
* Een vergelijkende studie maken van de sleutelelementen van de celcyclus in menselijke preimplantatie embryo's en menselijke embryonale stamcellen, om zo het nut van hESC als model voor vroege menselijke ontwikkeling te evalueren.
* De belangrijke chromosomale instabiliteit van hESC verklaren en zo cultuurcondities aanpassen om chromosomale afwijkingen te minimaliseren.
* De hoge frequentie aan aneuploidieën in menselijke embryo's uitleggen, het mechanisme van ontstaan van deze afwijkingen en van de zelf-correctie ontrafelen, en het belang van hun aanwezigheid evalueren, en eventueel een betrouwbare en snelle screening tool ontwikkelen om PGS te vervangen.
Hoewel de aangetroffen aneuploidieën wellicht de meest belangrijke factor zijn met een invloed op de implantatie van het embryo in de uterus, is het niet duidelijk in welke mate deze abnormaliteiten een rol spelen.
Ten eerste, zouden het aantal aangetroffen aneuploidieën een lagere verhouding van geïmplanteerde embryo's voorspellen na transfer, and ten tweede heeft de aanwezigheid van mosaicisme ertoe geleid dat een aantal onderzoekers vermoeden dat sommige aneuploidieën en het mosaicisme op latere stadia van het embryo worden gecorrigeerd, mogelijk door ofwel door selectieve migratie van abnormale cellen naar de trophectoderm of door apoptose. Deze factoren zouden kunnen uitleggen waarom PGS er niet in is geslaagd om het aantal zwangerschappen na IVF te verhogen, als aangetoond door onze eigen groep (Staessen et al., 2004 en 2008) en door anderen (Twisk et al., 2006). Daarentegen is er weinig geweten op het cellulair niveau over hoe deze afwijkingen ontstaan, hoe ze zichzelf corrigeren, en wat hun invloed op de ontwikkeling van het embryo is.
Menselijke embryonale stamcellen (hESC) worden afgeleid uit preimplantatie embryo's, en vormen een grote belofte op het gebied van regeneratieve geneeskunde omdat ze zich kunnen ontwikkelen naar om het even welk celtype in het volwassen menselijk lichaam. De laatste jaren werd door intensief onderzoek een aantal protocollen ontwikkeld voor de differentiatie van hESC naar volwassen celtypes (vb insuline-producerende cellen, Kroon et al., 2008). Op dit ogenblik bestaat er een zekere bezorgdheid omtrent de genomische instabiliteit van hESC tijdens in vitro cultuur. Wij (Spits et al., 2008) en anderen (Baker et al., 2007) hebben aangetoond dat hESC de neiging hebben om chromosomale abnormaliteiten te ontwikkelen, zoals aneuploidieën, uitdrukking van fragiele sites en kleine duplicaties met een hotspot op 20q21.11.
Deze genomische instabiliteit doet erg denken aan het gedrag van kankercellen, en veroorzaakt grote bezorgdheid omtrent het gebruik van hESC voor therapeutische doeleinden en als betrouwbaar onderzoeksmodel. Desondanks is ook hier weinig geweten over de ontstaansmechanismen van en de invloed van de cultuuromstandigheden op deze afwijkingen.
Onze hypothese is dat menselijke embryo's en stamcellen een celcyclus hebben die verschillend is van somatische cellen wat betreft de checkpunten, en dat dit de gevoeligheid van deze cellen voor chromosomale afwijkingen uitlegt.
De eukaryote cel vertoont vier checkpunten: het start checkpunt in de late G1 fase, het S fase checkpunt, het G2 naar M checkpunt en het spindle attachment checkpunt (SAC) gedurende de metafase naar anafase overgang.
Het eerste checkpunt beslist of de cel zal starten met replicatie van de chromosomen, en zal de celdeling stoppen in G1 wanneer het DNA beschadigd is, maar ook in geval van contact inhibitie, tekort aan groeifactoren en replicatieve veroudering. Het intra-S checkpunt checkt of er beschadigd DNA aanwezig is, en of de DNA replicatie is voltooid, door vb te zoeken naar replication forks. De rol van het G2 naar M checkpunt is voornamelijk het nakijken van DNA beschadiging gebruikmakende van een pathway die sterk op het G1 checkpunt lijkt. Tenslotte gaat het SAC na of alle centromeren correct gehecht zijn aan de mitotische spoelfiguur.
De verschillend checkpunten staan onder controle van grote proteïne complexen en cascades voor activatie, inductie en gecontroleerde degradatie. In de meeste cellen zal arrest door langdurige checkpunt activatie leiden tot apoptose. Daarentegen werd gerapporteerd dat embryonale stamcellen (ESC) van de meeste species in staat zijn om deze apoptose te vermijden door het checkpunt te negeren (Syljuasen, 2007), door het checkpunt los te koppelen, of door een inactief checkpunt. G1 checkpunt ontkoppeling werd gevonden in ESC van de resusaap (Fluckiger et al., 2006), de muis (Aladjem et al., 1998) en de mens (Qin et al., 2007).
Het G2 checkpunt is nog niet in detail bestudeerd in stamcellen, hoewel de resultaten van Chuykin et al. (2008) in de muis suggereren dat het detectie systeem voor beschadigd DNA actief is in deze cellen. Het SAC is actief in mESC, maar er werd aangetoond dat de cellen in staat zijn om aan arrest te ontsnappen en apoptose te vermijden (Mantel et al., 2007). Het lijkt er op dat alle checkpunten volledig actief worden en dus ook in staat zijn om apoptose te induceren wanneer stamcellen gaan differentiëren.
Daartegenover staat dat de cel cyclus controle in menselijke preimplantatie embryo's grotendeels onbekend terrein is. Het frequente voorkomen van aneuploidieën in menselijke embryo's lijkt er op te wijzen dat embryo's geen SAC hebben of dat ze checkpunt adaptatie ondergaan.
HESC worden afgeleid van de kiemknop van preimplantatie embryo's, en worden dikwijls beschreven als een goed model voor het onderzoek naar vroege menselijke ontwikkeling. Onze hypothese is dat de drie celcyclus checkpunten inactief zijn gedurende vroege menselijke preimplantatie ontwikkeling, mogelijk enkel gedurende de klievingstadia, of misschien enkel vóór de activatie van het embryonaal genoom op het vier-tot-achtcellig stadium (Caufmann et al., 2006). Het SAC zou het eerste volledig functionele checkpunt zijn (mogelijk in de late klievingstadia of in het blastocyststadium, waardoor zelfcorrectie in blastocysten zou kunnen worden uitgelegd) en de twee andere checkpunten zouden later in de ontwikkeling geactiveerd worden naargelang de differentiatie van de cellen en in analogie met hESC, waar men weet dat minstens één checkpunt (het G1) volledig functioneel is in gedifferentieerde maar niet in ongedifferentieerde cellen.
De doelen van dit project zijn:
* Een vergelijkende studie maken van de sleutelelementen van de celcyclus in menselijke preimplantatie embryo's en menselijke embryonale stamcellen, om zo het nut van hESC als model voor vroege menselijke ontwikkeling te evalueren.
* De belangrijke chromosomale instabiliteit van hESC verklaren en zo cultuurcondities aanpassen om chromosomale afwijkingen te minimaliseren.
* De hoge frequentie aan aneuploidieën in menselijke embryo's uitleggen, het mechanisme van ontstaan van deze afwijkingen en van de zelf-correctie ontrafelen, en het belang van hun aanwezigheid evalueren, en eventueel een betrouwbare en snelle screening tool ontwikkelen om PGS te vervangen.
Datum:1 jan 2010 → 31 dec 2013
Trefwoorden:reproductive genetics, andrology, clinical genetics, embryology, assisted reproductive technology
Disciplines:Basiswetenschappen, Biologische wetenschappen