< Terug naar vorige pagina
Project
Introductie van analytische scheidingstechnieken in de virologie om interacties op moleculair vlak bij picornaviridae op te helderen. (FWOAL435)
Door gebruik te maken van het celvrij systeem voor de aanmaak van virusmateriaal en initieel CE als scheidingstechniek, willen wij onopgeloste vraagstukken in verband met de structuur en de replicatie van picornavirussen, zoals de functie van sommige virale proteïnen, het mechanisme van de initiatie van proteïnen- en RNA synthese en de verschillende stappen in de morfogenese bestuderen. Het moet ons eveneens in staat stellen om - naast de onderwerpen die hoger werden aangehaald - (i) subvirale partikels te detecteren die ontstaan tijdens de replicatiecyclus van picornavirussen (morfogenese), (ii) interacties te bestuderen tussen het viraal genoom en subvirale partikels, die leiden tot het ontstaan van nieuwe virionen, (iii) interacties te onderzoeken tussen het viraal RNA en cellulaire proteïnen, (iv) interacties tussen virale en cellulaire proteïnen te beschouwen, (v) interacties tussen viraal RNA en virale proteïnen te volgen, waarbij telkens de stoichiometrie en affiniteit kan bepaald worden, en (vi) bijgevolg aangrijpingspunten te vinden voor potentiële antivirale geneesmiddelen.
Zoals reeds aangehaald kunnen de virale componenten slechts gedetecteerd worden nadat zij fluorescent gelabeld zijn, ofwel door een derivatisatie-reactie met een fluorofoor ofwel door intercalatie met een fluorofoor. Een probleem kan zich stellen wanneer men in een complex mengsel van proteïnen in het celextract de de novo gesynthetiseerde virale moleculen moet detecteren omdat de reactie niet specifiek is. In het verleden werden er radioactieve precursoren toegevoegd waarbij vervolgens op een relatief eenvoudige manier de geïncorporeerde radioactiviteit kon gemeten worden die slechts aanwezig was in de novo gesynthetiseerde virale moleculen. Om het gebruik van radioactiviteit af te bouwen en omdat het praktisch moeilijk of niet haalbaar is om de radioactiviteit van monsters te meten bij CE, willen we graag het gebruik van niet-natuurlijke aminozuren introduceren in de moleculaire virologie. Tot nu toe waren onderzoekers beperkt tot het gebruik van de 20 natuurlijk voorkomende aminozuren (al of niet radioactief gemerkt). Maar vorderingen in de chemische biologie bieden ons nu de toegang tot een breder arsenaal van aminozuren die chemisch gewijzigd werden. Afhankelijk van de chemische modificatie kunnen deze aminozuren bij verschillende toepassingen gebruikt worden. Zij kunnen ingezet worden bij de detectie van virale proteïnen, ofwel omdat zij reeds verbeterde fluorescerende eigenschappen bezitten, zoals het 5-hydroxy-L-tryptofaan [15], ofwel omdat zij nieuwe reactieve groepen, zoals alkynen, bezitten die het mogelijk maken om proteïnen selectief fluorescent te labelen. Een andere mogelijkheid bestaat erin om fotoactiveerbare crosslinkers bij leucine en methionine [16] te introduceren om proteïne-proteïne interacties beter te bestuderen. Het interessante aan deze niet-natuurlijke aminozuren is dat wanneer zij geïncorpeerd worden, het proteïne zijn activiteit en functionaliteit behoudt.
Zowel bij gebruik van fluorescentielabelling, derivatisatie als bij de introductie van niet-natuurlijke aminozuren moeten de analytische CE bepalingen geoptimaliseerd worden. Dat geldt evenzeer voor de voorwaarden waaronder de (derivatisatie) reacties uitgevoerd worden. Dergelijke optimalisaties zullen binnen dit project eveneens beschouwd worden. We denken hierbij aan een aanpak gebaseerd op het gebruik van experimentele designs.
Zoals reeds aangehaald kunnen de virale componenten slechts gedetecteerd worden nadat zij fluorescent gelabeld zijn, ofwel door een derivatisatie-reactie met een fluorofoor ofwel door intercalatie met een fluorofoor. Een probleem kan zich stellen wanneer men in een complex mengsel van proteïnen in het celextract de de novo gesynthetiseerde virale moleculen moet detecteren omdat de reactie niet specifiek is. In het verleden werden er radioactieve precursoren toegevoegd waarbij vervolgens op een relatief eenvoudige manier de geïncorporeerde radioactiviteit kon gemeten worden die slechts aanwezig was in de novo gesynthetiseerde virale moleculen. Om het gebruik van radioactiviteit af te bouwen en omdat het praktisch moeilijk of niet haalbaar is om de radioactiviteit van monsters te meten bij CE, willen we graag het gebruik van niet-natuurlijke aminozuren introduceren in de moleculaire virologie. Tot nu toe waren onderzoekers beperkt tot het gebruik van de 20 natuurlijk voorkomende aminozuren (al of niet radioactief gemerkt). Maar vorderingen in de chemische biologie bieden ons nu de toegang tot een breder arsenaal van aminozuren die chemisch gewijzigd werden. Afhankelijk van de chemische modificatie kunnen deze aminozuren bij verschillende toepassingen gebruikt worden. Zij kunnen ingezet worden bij de detectie van virale proteïnen, ofwel omdat zij reeds verbeterde fluorescerende eigenschappen bezitten, zoals het 5-hydroxy-L-tryptofaan [15], ofwel omdat zij nieuwe reactieve groepen, zoals alkynen, bezitten die het mogelijk maken om proteïnen selectief fluorescent te labelen. Een andere mogelijkheid bestaat erin om fotoactiveerbare crosslinkers bij leucine en methionine [16] te introduceren om proteïne-proteïne interacties beter te bestuderen. Het interessante aan deze niet-natuurlijke aminozuren is dat wanneer zij geïncorpeerd worden, het proteïne zijn activiteit en functionaliteit behoudt.
Zowel bij gebruik van fluorescentielabelling, derivatisatie als bij de introductie van niet-natuurlijke aminozuren moeten de analytische CE bepalingen geoptimaliseerd worden. Dat geldt evenzeer voor de voorwaarden waaronder de (derivatisatie) reacties uitgevoerd worden. Dergelijke optimalisaties zullen binnen dit project eveneens beschouwd worden. We denken hierbij aan een aanpak gebaseerd op het gebruik van experimentele designs.
Datum:1 jan 2008 → 31 dec 2009
Trefwoorden:Virology, Separation, Microbiology, Analytical chemistry
Disciplines:Biologische wetenschappen, Chemie, Farmaceutische wetenschappen