Karakterisering van een thermofiele acidogene microbiële gemeenschap die organisch afval afbreekt met productie van de hoogwaardige chemicalie capronzuur door gebruik te maken van een combinatie van “culturomics” en meta-omica

Voorgestelde schets van het proefschrift: Dit onderzoek beoogt de ontwikkeling van een biologisch model dat de metabole interacties in de biologische anaerobe afval-verteringsreactor C1 van het MELiSSA-systeem verklaart. Dit systeem, gebaseerd op een ecosysteem van meren, richt zich op het recyclen van afval door voornamelijk microbiële reacties, tijdens lange termijn ruimtemissies. Vier hoofdactiviteiten worden uitgevoerd om een gevalideerd biologisch metabool model van de complexe microbiële gemeenschap van de C1-reactor te verkrijgen. Het werk zal beginnen met achtergrondinformatie over de dominante sleutelsteenpopulaties die aanwezig zijn in het systeem onder stabiele prestaties. Ten eerste, de effecten van niet-stationaire omstandigheden (pH of temperatuur purtubaties) op de C1 gemeenschapssamenstelling worden onderzocht met behulp van metagenomics / metaproteomics. Dit geeft aan of andere soorten al dan niet als sleutelsteen moeten worden beschouwd. Ten tweede zullen de meta-omische gegevens van het eerste experiment worden gebruikt om key-stone soorten / pathways / metabolische netwerken in detail te beschrijven door middel van cooccurrence-analyse en key-stone individuele genomen zullen worden gereconstrueerd. Ten derde zullen de substraatspecifieke rol en metabole functies van de sleutelsteensoorten in C1 worden opgehelderd / geverifieerd / gedetailleerd door gebruik te maken van time-lapse 16S rRNA-gen / transcripselsequentiebepaling en DNA / eiwit Stabiele isotooponderzoek na incubatie met individuele afvalverbindingen en structuren. Eindelijk de bijdrage van C1 Keystone-soorten voor specifieke substraatconversie zullen worden onderzocht door hun activiteiten en interacties in kunstmatige co-culturen te bestuderen na hun (op een metagenoom gebaseerde) isolatie van de complexe gemeenschap. Voorlopige beschrijving van de doelstelling (en) van het proefschrift (onderzoeksplan), de methodologie, timing en eventueel eerder uitgevoerd onderzoek met betrekking tot het heden voorstel: Het Micro-Ecologische Life Support System Alternative (MELiSSA) is een concept ontwikkeld door het European Space Agency (ESA), dat voortkwam uit de behoefte aan een regeneratief systeem voor levensonderhoud voor ruimtemissies op lange termijn. Het concept is geïnspireerd op een ecosysteem van meren en is opgevat als een gesloten lussysteem dat bestaat uit 4 biologische compartimenten (C1 en C4) die door gecombineerde activiteit van verschillende organismen organisch afval recyclen tot nieuw voedsel voor het ruimtevaartpersoneel (Hendrickx et al., 2006 ). De robuustheid van de MELiSSA-lus is gebaseerd op het bouwen van robuuste, gestructureerde en voorspellende wiskundige modellen die alleen kunnen worden geïmplementeerd door een grondige kennis van de samenstelling, het gedrag, de metabolismes, kinetiek, beperkingen, remmingen, enz. Van elk subsysteem. Het C1-compartiment is het eerste compartiment in de cyclus. Een thermofiel anaeroob microbieel consortium maakt het vaste afval vloeibaar en produceert ammonium, vluchtige vetzuren (VFA's), CO2 en mineralen. Het algemene doel van dit onderzoek is het verkrijgen van een gevalideerd biologisch metabool model dat de metabolische interacties beschrijft binnen de complexe microbiële gemeenschap van het MELiSSA-compartiment voor afvalafbraak C1. Het onderzoek zal beginnen met de beschikbare achtergrondinformatie van het gastlaboratorium waarin een voorlopig microbieel netwerk wordt beschreven dat rapporteert over de potentiële hoofdsteensoorten en functionaliteit (voornamelijk gebaseerd op hoge abundantie) in de C1-reactor bij steady-state prestaties afgeleid van metaomische gegevens verkregen uit meerdere reactoroperaties onder standaardomstandigheden. Meer specifiek, het onderzoek valideert en detailleert (1) dit voorlopig microbieel netwerk, (2) de overeenkomstige metabole routes en (3) de geïdentificeerde belangrijkste soorten / functies / biomarkers van C1. Om deze doelstellingen te bereiken, zullen de volgende activiteiten (als WP's) worden uitgevoerd. In WP1 zullen C1-reactoren in een vergelijkbare modus worden gebruikt om de achtergrondinformatie te verkrijgen, behalve kleine afwijkingen in de samenstelling van de reactortoevoer en daarbij veranderingen in het dieet en afval van astronauten na te bootsen (Poughon et al., 2013). Naast de prestatieparameters van de reactor, zal de C1 microbiële gemeenschapssamenstelling worden gevolgd door metagenomics / metaproteomics. In andere reactorexperimenten zullen voorbijgaande, meer ingrijpende (pH of temperatuur) verstoringen worden geïmplementeerd. Bovendien zal de gemeenschapssamenstelling van een moeder-C1-reactor die gericht is op het produceren van Cl-reactorinoculum worden bewaakt om de gemeenschapsstabiliteit op lange termijn te detailleren. Deze experimenten zullen ons informeren over de dynamiek en veerkracht van de C1-gemeenschap bij kleine en grote verstoringen. Er zal worden onderzocht of de sleutelsteensoorten en -functionaliteiten blijven / verschijnen na verstoringen en of andere soorten als sleutelsteen moeten worden beschouwd. Bovendien zal extra en nodig voldoende sequentie-informatie worden verzameld voor gedetailleerde route en microbiële / metabole netwerkanalyse in WP2. In WP2 zal de meta-omische informatie verkregen in WP1 en de achtergrond-meta-omische informatie worden gebruikt om (1) sleutelstonespecies verder te identificeren en te beschrijven, (2) om key-stone individuele genomen te reconstrueren met behulp van geschikte metagenomische binaire benaderingen ( Kang et al., 2015) en (3) om keystone-paden / metabole netwerken in de C1-gemeenschap te detailleren. Vergelijkende en longitudinale meta-omic cooccurrence-analyse zal worden uitgevoerd om andere key-stone-soorten aan te geven naast de overvloedige soorten, d.w.z. niet-dominante soorten die naast de dominante soort bestaan (Faust et al., 2012). Evenzo zal gelijktijdig optreden van functionaliteit worden geanalyseerd. Sleutel tot het succes van co-occurrence-analyse is de beschikbaarheid van sequentie-informatie over voldoende monsters / replicaten en de toepassing van goedgekozen verstoringen / condities (zoals uitgevoerd in WP1). De annotatie-analyse van de afzonderlijke key-stone soortengenomen en de mapping van de meta-proteomen daarop zullen de mogelijke functies / activiteiten / interacties van de belangrijkste soorten / routes in de C1-reactor beschrijven en mogelijke microbiële netwerken en zelfs extra sleutel afleiden -steensoort gebaseerd op complementatie van wegen (Faust en Raes, 2012; Roume et al., 2015). WP3 zal worden gebruikt om de substraatspecifieke rol en metabole functies van de sleutelsoorten in C1 verder toe te lichten / te verifiëren / te preciseren. In een eerste taak, in kleinschalige batchexperimenten, wordt de C1-gemeenschap gevoed met individuele substraten die aanwezig zijn in de standaard aanvoer en time-lapse. 16S rRNA-gen / transcriptsequencing zal die belangrijke stenen soorten opsporen die zich vermenigvuldigen, wat wijst op hun rol in het gebruik van bepaalde substraten. Geteste substraten zijn componenten van de standaardvoeding zoals uitwerpselen, salade, toiletpapier en chemische basisstructuren zoals cellulose, glucose, individuele VFA's, eiwitten, peptiden, enz. Bij een tweede taak worden de laatstgenoemde verbindingen gevoed als 13C-gelabelde varianten en time-lapse DNA / eiwit Stabiele isotopentetentie (DNA / eiwit-SIP) (Jehmlich et al., 2016; Chen en Murrell, 2010) zullen worden gebruikt om die soorten en routes (en het vervolg) aan te geven die de respectieve substraten actief omzetten. Tegelijkertijd worden gemeenschapssteekproeven onderworpen aan een metabolomische analyse om de aanwezigheid / activiteit van metabole routes voor de verschillende substraten aan te geven (Zimmermann et al., 2015; Bouvin et al., 2015). De SIP- en metaboloominformatie van het DNA / eiwit zal worden gekoppeld om substraatspecifieke metabole netwerken in C1 af te leiden. Aangezien redundantie in functie wordt verwacht, d.w.z. verschillende soorten kunnen betrokken zijn bij de conversie van dezelfde structuur, zal de respectievelijke bijdrage van een of andere sleutelsteensoort aan substraatomzetting onbekend zijn. Een eerste indicatie wordt gegeven door de relatieve abundantie van de respectieve soort in de 13CDNA- en 13C-eiwitfractie, mogelijk met een bevestiging van intermediaire metabolieten uit metaboloomanalyse en hun groeisnelheden zoals gevolgd door gerichte qPCR. Er zal bewijs worden verkregen in WP4 door substraatomzetting en groeisnelheden van de sleutelsteensoorten afzonderlijk en binnen gereconstrueerde kunstmatige gemeenschappen te onderzoeken. Hiertoe worden sleutelsteensoorten geïsoleerd gebruikmakend van een innovatieve metagenomics-gebaseerde isolatiebenadering, d.w.z. van de gereconstrueerde genomen en potentiële metabole activiteiten (zie WP2), worden media die selectief de belangrijkste steensoort groeien gedefinieerd (Gutleben et al., 2017). Dit lijkt haalbaar omdat de meeste van de dominante keystone-soorten Clostridia zijn die eerder werden gekweekt (Kersters et al., 1994). Als alternatief zullen we soortgelijke (genoom gebaseerde) organismen uit kweekcollecties gebruiken. Samen met informatie van WP2 en WP3 zal deze informatie leiden tot een interactief metabolisch metabolisme van de C1-gemeenschap.