De rol van structurele dynamieken in proteïne functie en evolueerbaarheid.

Tijdens de evolutie worden 'peptiden' omgezet in 'eiwitten' door de specifieke functies op een geavanceerde manier aan dergelijke biopolymeren te delegeren. Van alle beschikbare conformeren moet de natuur een subset ervan selecteren om elk eiwit specifieke substraten te laten herkennen. Tijdens de korte evolutieperiode kan een dergelijke functionele specialisatie van een peptide met een vaste lengte getrouw worden verklaard door de theorie van de ontwikkelbaarheid van eiwitten. Om de evolutie van de niet-vaste lengte peptiden die op een lange termijn kunnen voorkomen te rationaliseren, hebben we ons gefocust op het uitbreiden van de huidige evolueerbaarheidstheorie door het introduceren van de proteïne modulariteit in dit proefschrift.

Om het concept van eiwitmodulariteit volledig te begrijpen, hebben we in Hoofdstuk 1 een overzicht gegeven met de samenvatting van twee fundamentele studies: (i) de multi-tier eiwitdynamiek en (ii) de evolueerbaarheid van eiwitten. Het hoofdstuk bevat ook een korte uitleg van het energetische trechtermodel, omdat het ons in staat stelt om de evolutie van de proteïne-energetica en -structuren op basis van functionele specialisatie te veronderstellen. Door deze algemeen aanvaarde concepten uit te werken, zijn we in staat een werkhypothese te vormen over de rol van de eiwitmodules, zoals we in het volgende Hoofdstuk 2 hebben gepresenteerd.

Hoofdstuk 2 geeft een generieke werkhypothese van dit proefschrift door de rol van de modules om de functie van eiwitten tijdens de evolutie te specialiseren ter discussie te stellen. Om deze hypothese te verifiëren, hebben we een grote groep eiwitten onderzocht die een gemeenschappelijke 'primordiale' structuur aannemen, namelijk de 'cherry-core' (CC). De CC geïdealiseerde consensus, die is samengesteld uit twee continue Rossmann-fold Domeinen (D1 en D2) verbonden via twee anti-parallelle β-sheet 'hinges' (βH1 en βH2), vertoont een opmerkelijke symmetrie die kan bijdragen aan de conformationele variabiliteit en plasticiteit. Vervolgens hebben we voorgesteld dat de geometrische plaatsing van de modules (d.w.z. C-terminaltoevoegingen) in de CC de meerlaagse dynamiek op de CCP's mogelijk maakt.

Om de hypothese uit het vorige hoofdstuk te testen, hebben we grootschalige domeinbewegingen onderzocht via single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) en lokale structurele fluctuaties via Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) van de CCP's en hun derivaten. In Hoofdstuk 3 ontdekten we dat de modules van CCP's een verschillende structurele dynamiek op meerdere niveaus aan de CC geven. Een dergelijke dynamiek maakt de diversificatie van functie en ligandspecificiteit van de CCP's mogelijk. In dit hoofdstuk hebben we ons gericht op het benadrukken van de rol van asymmetrische C-staart om tier-0 dynamiek te 'genereren' op SBD2 en MalE van respectievelijk Klasse B en G. Dergelijke eiwitten zijn ABC-transporter-gerelateerde eiwitten, die twee verschillende conformaties vereisen om hun verwante liganden te vangen (d.w.z. open in de apo- en gesloten in de holo-toestand). Door specifieke interacties op de C-staart te verstoren, destabiliseren we de open apo-toestand en vergroten we hun bindingsaffiniteit. Dergelijke resultaten bevestigen de rol van de modules van de ABC-transporter-gerelateerde CCP's om de 'open' conformatie als de oorspronkelijke apo-toestand te genereren.

De CC van de LysR Type Transcription Regulators (LTTR's) heeft geen extra C-staart-module en werkt als het effector-bindende domein (EBD). We hebben aangetoond dat Tier-0-dynamiek niet waarneembaar is op de EBD van CynR en mogelijk niet vereist is tijdens effectorbinding om de quaternaire veranderingen te verspreiden. In Hoofdstuk 4 hebben we de dynamiek van het lagere niveau die ten grondslag ligt aan de functie van CynR gevolgd door de combinatie van structurele modellering en dynamica-studies (d.w.z. HDX-MS) te gebruiken. Hoewel er geen significante structurele veranderingen zijn waargenomen op de CC die is gedetecteerd met onze experimentele procedures, stelden we voor dat de accumulatieve dynamiek van de lage niveaus mogelijk voldoende is om de quartaire veranderingen te initiëren die essentieel zijn voor het DNA-(ont)buigen.

In Hoofdstuk 5 hebben we het effect van de modules op de structurele dynamiek van een van de moderne CCP's bepaald, namelijk het Maltose Binding Protein (MalE). Zulke modules zijn voornamelijk ingebed in de C-terminy en geïntegreerd in de geconserveerde structuur, meer als vervangers van consensus helices / sheets, zoals beschreven in Hoofdstuk 2. We hebben de rol van dergelijke modules geverifieerd met behulp van een reeks biofysische tools (bijv. SmFRET, HDX-MS en Isothermal Titration Calorimetry) en MD-simulaties waarmee we het energetische landschap van MalE konden reconstrueren. Door dergelijke modules te veranderen met behulp van plaatsgerichte mutagenese, hebben we de synergetische rollen van de modules bevestigd, die cruciaal zijn om MalE te personifiëren om te functioneren als een transportgerelateerd bindend eiwit door (i) het ligand in te sluiten en (ii) een aparte apo-toestand te creëren.

We verwachtten dat de energetische argumenten tijdens de evolutie zouden kunnen worden gezien als de belangrijkste selectiedruk. Om aan de energetische behoefte te voldoen, zou de natuur modules kunnen introduceren in de hoog-evolueerbare eiwitkernen tijdens de lange evolutieperiode, zoals we in dit proefschrift hebben gepresenteerd over het modulariteitsconcept. Zodra de modules zijn 'gehecht', is evolutie op een peptide met vaste lengte voldoende om de eiwitfuncties te optimaliseren. Het latere evolutieproces zou in een relatief kortere evolutieperiode kunnen plaatsvinden, zoals vermeld in de ‘avant-garde’ evolueerbaarheidstheorie.