Pathofysiologische karakterisatie van megakaryopoïese en erythropoïese: whole genome sequencing en functionele studies

Mijn doctoraatsproject had als doel meer inzicht te krijgen in megakaryopoïese en erytropoïese door respectievelijk patiënten met erfelijke trombocytopenie en erfelijke anemie te bestuderen.

Ten eerste identificeerde het lab waar ik mijn project uitvoerde in 2016 een erfelijke heterozygote missense variant ‘E527K’ in het SRC gen in een grote stamboom met dominante trombocytopenie, met behulp van ‘whole genome sequencing’. Patiënten die drager zijn van deze E527K SRC variant vertonen trombocytopenie die gepaard gaat met bloedingssymptomen, een gebrek aan alpha granules en een verscheidenheid aan andere symptomen, waaronder myelofibrose, osteoporose en dysmorfie van het gezicht. De E527K SRC variant bleek te resulteren in een verhoogde SRC kinase activiteit en defecten in de vorming van bloedplaatjes, maar ‘downstream signaling pathways’ vanwege verhoogde kinase activiteit in megakaryocyten (MK) bleven nog steeds onbekend. Aan het begin van mijn doctoraatsproject kon ik de klinische en laboratoriumbevindingen beschrijven bij een tweede trombocytopenie patiënt met dezelfde gain-of-function (GOF) variant E527K in SRC. Hoewel er al veel functionele testen waren uitgevoerd om de causaliteit van deze GOF variant in SRC te bewijzen voor het klinische fenotype van de patiënten van deze grote stamboom, versterkte de bevestiging bij deze patiënt uit een onafhankelijke familie deze bevindingen aanzienlijk en dit maakte een verbeterde afbakening van deze nieuwe bloedplaatjesaandoening mogelijk. Vervolgens wilden we inzicht krijgen in het MK defect geïntroduceerd door de SRC GOF variant met behulp van transcriptomische en proteomische benaderingen. Voor deze experimenten werden hematopoïetische stamcellen (HSC) geïsoleerd uit gezonde controles vóór transductie met WT-SRC en E527K-SRC lentivirale vectoren en differentiatie naar MK. De RNAsequencing data toonde aan dat veel van de meest significante down-gereguleerde genen in E527K-SRC MK betrokken waren bij de activering van bloedplaatjes, signalering en alpha granules, wat mooi overeenkwam met het defect van de bloedplaatjesfunctie dat bij deze patiënten werd beschreven. De gecombineerde pathway analyse met behulp van zowel RNAsequencing als proteomics datasets identificeerde ook IFNα/β-signaling als de meest significante down-gereguleerde pathway in E527K-SRC MK. We hebben verschillende validatiestudies uitgevoerd in celmodellen en ontdekten dat interferon-gestimuleerde genen (ISG) een rol spelen tijdens megakaryopoïese door ‘downstream’ SRC signaling te werken. De exacte mechanismen van hoe SRC de ISG kan veranderen om megakaryopoïese te beïnvloeden blijven nog onbekend en vereisen verder onderzoek.

Ten tweede werd whole exome sequencing (WES) uitgevoerd voor een patiënt met ernstige anemie. Zij en haar zus werden geboren uit bloedverwante ouders en zeldzame homozygote WES-varianten werden als kandidaten geselecteerd. De meest plausibele kandidaat was een homozygote missense variant in DAP3 die codeert voor het mitochondriale Death-Associated Protein 3. Daarom was het tweede deel van mijn doctoraatsproject het bestuderen van de rol van DAP3 in erytropoïese, door functionele studies uit te voeren in HSC-afgeleide erytroblasten, RNAsequencing en dap3 ‘depletion’ bij zebravissen. HSC van de patiënt vertoonden een verminderde vorming van erytroblast kolonies met voornamelijk kleinere kolonies. Flow cytometrie analyse onthulde een significante vertraging van de maturatie van erytroblasten voor van de patiënt afgeleide celculturen en met verminderde functionele mitochondria. De analyse van RNAsequencing data voor A-naar-I RNA editing toonde een significant verminderde editing frequentie voor 127 locaties in de buurt van 40 genen in patiëntencellen. Reactome pathway analyse van deze genen toonde een verrijking van de celcyclus en RNA metabolisme pathways. Ten slotte vertoonden ‘dap3-depleted’ zebravis embryo's verminderde aantallen erytrocyten, verminderde expressie van gata1 en embryonale globine genen, en verhoogde aantallen apoptotische cellen. Samenvattend onthulde onze data een belangrijke rol voor DAP3 tijdens erytropoïese via de regulatie van de mitochondriale gezondheid en bewijs voor A-naar-I RNA editing in dit proces.