Project
Optimalisatie van een faagtherapie tegen bacteriële pathogenen in kool en prei
Xcc en Pspo zijn zaadovergaande bacteriën. Daarom wordt een vaststelling in een gewas dikwijls toegewezen aan besmetting van zaden die dan op de plantenkwekerijen wordt overgezet op de jonge planten. Zaadbedrijven doen nochtans inspanningen om gezonde zaden te leveren. Maar de routes voor zaadbesmetting zijn nog niet volledig gekend en een micro-besmetting kan in de gunstige omstandigheden macroschade aanbrengen. De genetische structuur van de Xcc en Pspo stammen van de Vlaamse velden vertoont niet de variatie die je zou verwachten als de bacteriën gangbaar door besmette zaden worden geïntroduceerd. Hieruit volgt dat in Vlaanderen bodembesmetting de belangrijkste (bron) zou zijn voor infectie.
Er is aangetoond dat Xcc koolplanten langs de wortels kan infecteren. De bacterie koloniseert dan het vasculair systeem. Voor jonge bloemkoolplanten was een relatief hoge hoeveelheid bacteriën aan de wortels (drench) en wortelbeschadiging (knippen) nodig voor symptomatische infectie. Als bloemkoolplantjes cv. Giewont zonder mechanische wortelbeschadiging in een besmette grond van 104, 106of 108 Xcc/g werden opgekweekt, dan werden na 12 weken geen symptomen van zwartnervigheid vastgesteld in de bladeren.
De analyse van het vaatweefsel van een stengelsegment net boven de wortels door selectieve isolatie en TaqMan PCR toonde Xcc ook niet aan als latente infectie in de individuele koolplanten. Blijkbaar was de infectie daar niet geïnstalleerd. In wortelmonsters werd Xcc door TaqMan PCR wel sporadisch aangetoond in het object 106 Xcc/g (1/18 planten) en in het object 108 Xcc/g (7/18 planten). Dat de infectie niet in het bovengronds vasculair systeem van de koolplanten is vastgesteld heeft mogelijks te maken met de bijwijlen hoge temperatuur (tegen 40°C) in de serrecompartimenten. Provisoir kan worden aangenomen dat vasculaire infectie van Xcc in koolplanten vanuit een besmette bodem mogelijk is maar onvoorspelbaar is en traag verloopt. Omdat beschadiging van de wortels de infectie bevordert zijn op koolpercelen plaatsen waar die zich kunnen voordoen, zoals aan spuitsporen. Het is evenwel weinig waarschijnlijk dat de gebruikte niveaus van bodembesmetting op koolpercelen zouden optreden. Het is aannemelijk dat bodembesmetting in het ontstaan van infecties vooral Xcc met opspattend water op koolbladeren doet afzetten. Alternatief kan Xcc vanuit de wortels doorheen het vasculair systeem in gutatiedruppels aan de bladrand worden gebracht waarna infectie daar aanvangt.
In een gelijkaardig experiment werden preiplanten cv. Harston niet in de wortels geïnfecteerd in besmette preigrond. De bacterie is geen vasculair pathogeen. Ze overleefde wel aan de preiwortels. Als bijgevolg prei in een besmette bodem wordt geplant dan moet de bacterie eerst op de bladeren worden afgezet, bv. via opspattend water, om infectie te veroorzaken. Bodembesmetting kan dus van belang zijn tijdens de opkweek van jonge planten. Experimenteel werd prei gezaaid in besmette grond met 106 en 108 Pspo/g en werd de bacterie van respectievelijk 19 en 81 van 100 kiemplanten met TaqMan PCR gedetecteerd. De bacterie had zich epifytisch op de zaailingen geïnstalleerd, net zoals die dat doet op zaailingen vanuit besmette zaden. Dit impliceert dat fagen de preibladeren reeds op het zaaibed moeten beschermen. Na uitlichten van de planten op het zaaiperceel wordt blad immers goed ingekort. Deze beschadiging versmeert de bacterie en werkt infectie in de hand. Faagbehandelingen op het zaaibed zijn bijgevolg aangewezen om het primair inoculum van Pspo klein mogelijk te houden. Aangezien besmetting van Pspo in zaadloten niet denkbeeldig is, kunnen fagen vanaf de kieming bescherming bieden.
De besmetting van het plantsubstraat werd uitgevoerd met bacteriezieke kool- of preibladeren gehomogeniseerd met water in een blender. De bacterie bevond zich in virulente toestand. In de uitgevoerde simulaties werden de besmettingen onecht hoog aangemaakt zodat binnen een relatief kort tijdskader de uitwerking van de test kon worden gemeten. In gepubliceerd onderzoek is de natuurlijke besmetting op kool- en preipercelen zelden hoger dan 104bacterie/gram grond. Het aandeel van bodembesmetting in ontstaan van bacterieziekte in kool en prei wordt sterk bepaald door de onderzoeksmethodiek (planktonische cellen of zieke plantenresten, uitkweken van de bacterie op semiselectieve voedingsmedia of detectie in PCR). Gebruik van een GFP-gelabelde Xcc en Pspo stam kan meer inzicht brengen in het aandeel van bodembesmetting in de infecties van koolplanten.
Taak 2: Kwantitatieve PCR voor faag trackingEen detectietool werd ontwikkeld en uitgewerkt om de gebruikte fagen op te sporen in de bodem en in/op planten. De real-time PCRs op het SYBR Green principe werden ontworpen uit de genomische sequenties van de KIL-fagen van Pspo en de SoPhi-fagen (later hernoemd als FoX-fagen) van Xcc. De assays werden geoptimaliseerd op gevoeligheid en specificiteit.
De specifieke detectie van de KIL-fagen kan worden gedaan met een 101 bp sequentie in een gen dat codeert voor een putatieve serine protease. De gevoeligheid van de assay in faagbuffer (Level Of Detection) is 5 kopijen in de PCR reactie bij een gemiddelde Ct-waarde van 36,3. De test toont een efficiëntie van 94% over 8 logs faag DNA. De vijf KIL-fagen worden gedetecteerd (100% inclusiviteit). Zowel in silico analyse als in labtesten detecteerde de assay geen andere fagen (100% exclusiviteit).
Het was niet mogelijk om alle FoX-fagen in één assay te detecteren. In een bio-informatica pipeline met aangepast script werden 3 primersets uitgewerkt voor FoX1/FoX2 en 4 primersets voor FoX4 met amplicons van 100 bp tot 102 bp. De gevoeligheid van de meest geschikte assay in faagbuffer (Level Of Detection) is 85 kopijen in de PCR reactie bij gemiddelde Ct-waarde van 34. Detectie van FoX-fagen is minder gevoelig dan van KIL-fagen. De test toont een efficiëntie van 94% over 9 logs faag DNA. De FoX2 primers bleken naderhand ook de FoX3- en FoX5-fagen te detecteren.
Voor toepassing van de qPCRs in plant- en grondmonsters werd verdere validatie uitgevoerd met gBlocks, synthetische DNA moleculen van de doelsequenties van de KIL en FoX fagen (304 bp). Die werden toegevoegd aan extract van respectievelijk koolwortels en preiblad. Detectie werd verkregen tot 0.05 fg gBlock in de PCR reactie, wat overeenkomt met 152 kopijen in de PCR reactie. Toepassing van de qPCR assays in wortel- of bladextract heeft een nadelig effect op de LOD. Daarom is de isolatie van DNA via een extractiekit wenselijk.
Monsters van 250 mg koolwortels werden gespiked met faagoplossing FoX2 + FoX4 van 2.106 tot 2.10-1pfu/ml. De isolatie van gDNA werd uitgevoerd met de Qiagen DNeasy Powersoil Pro kit en 5µl hiervan werd toegevoegd aan de qPCR assay voor FoX2 en FoX4. De FoX2 qPCR gaf gedegradeerde FoX-faag aan maar de FoX4 qPCR assay vertoonde een duidelijke gradiënt van Ct-waarden overeenkomstig de toegevoegde faaghoeveelheden.
De qPCR testen werden verder geëxploiteerd in het onderzoek.
Taak 3: Bioassays voor bodemapplicatie van fagen in de kolenteelt en voor bladapplicatie van fagen in de preiteeltBioassays prei
Aangezien Pspo infecties in de loop van dit project minder relevant bleken te zijn voor de praktijk (er worden de laatste jaren weinig tot geen Pspo infecties waargenomen) en we al eerder een werkende bioassay met fagen publiceerden (Rombouts et al. Front. Microbiol. 2016, 7, 1–15), hebben we ons vooral gefocust op bioassays in kool (zie verder).
In het laatste jaar hebben we een andere bioassay ontwikkeld. Jonge preiplanten (Harston) werden hiervoor bespoten met faagoplossing en 0.05% Silwet Gold als uitvloeier. Na drogen (+/- 30 min) werd een bacterieoplossing gespoten op de planten. De topjes van de planten werden 14 dagen na infectie afgeknipt om de hoeveelheid bacteriën te kwantificeren via qPCR. Bij een MOI (multiplicity of infection; de faag:bacterie verhouding) van 10 is er een stijging van het aantal Pspo-negatieve planten, een resultaat dat voorzichtig positief is.
Bioassays kool
Op basis van WP2 (zie verder) werden FoX2 en FoX6 geselecteerd als optimale faagcocktail tegen Xcc. Zowel FoX2 als FoX6 werden vervolgens geëvalueerd in een irrigatie-gebaseerde faagtoepassing. Hiervoor werd eerst als preliminaire test de opname van de faag door de plant getest door een concentratiegradiënt aan faagcocktail FoX2/FoX6 (106 - 107 - 108 - 109 - 1010 PFU/mL) te voeden aan bloemkoolzaden (Giewont) als phytodrip (1 ml per zaad, 5 herhalingen, 4 zaden per herhaling). De negatieve controle zaden kregen faagbuffer. Na faagtoepassing in de bodem werden de zaailingen opgegroeid op 16°C onder een 16u/8u dag/nacht regime tot het BBCH10 groeistadium (14 dagen, eerste echte blad zichtbaar). Vervolgens werden de zaailingen uit de bodem getrokken en drie maal gewassen met 10 ml faagbuffer/0,1% Tween20 en eenmaal met steriel water om de externe fagen te verwijderen. Na homogenisatie werd het plantenmateriaal geresuspendeerd in 1 ml faagbuffer, waarna het werd gecentrifugeerd (10000 g). Tenslotte werd het supernatans gefilterd (0,45 µm) en werd de faagconcentratie van FoX2 en FoX6 bepaald door titratie op respectievelijk GBBC1419 en GBBC1412. Bij een behandeling van 106 en 107 PFU fagen konden geen fagen worden gerecupereerd uit het plantenweefsel, terwijl bij de hogere concentraties van behandelingen wel fagen konden worden geisoleerd uit de zaailingen, hetgeen aantoont dat de zaailingen wel degelijk de fagen opnemen en dat ze getransporteerd worden in de plant. De concentratie in de zaailingen is dosisafhankelijk en de minimale concentratie aan faag om fagen terug te kunnen vinden in de plant is 108 PFU/ml.
Omdat we nu weten dat fagen worden opgenomen in de plant na phytodropbehandeling werd een bioassay uitgevoerd om de effectiviteit van deze faagbehandeling tegen Xcc infectie na te gaan. Hiervoor werden 150 bloemkoolzaden (Clarina) bij uitzaaien behandeld met 108 of 109PFU faagcocktail. Vervolgens werden ze gedurende 5 weken opgegroeid en wekelijks behandeld met dezelfde hoeveelheid fagen als bij zaai door aangieten. Per plant werden dan vier bladeren geïnfecteerd met Xcc (GBBC1412 of GBBC1419; 10 planten per conditie) door ze in te knippen met een schaar die werd gedompeld in bacteriesuspensie (108 CFU/ml). De planten werden bewaard on hoge luchtvochtigheid en geëvalueerd na 10 dagen op Xcc symptomen.
Deze bioassay toont aan dat behandeling met 109 PFU FoX2 voldoende is om infectie met GBBC1419 (invasief door een knip in het blad) te voorkomen (significant op p-value 0.0002). FoX6 behandeling werkt niet om infectie met GBBC1412 te voorkomen. Enkel FoX2 blijkt dus efficiënt te zijn in planta onder deze omstandigheden.
Omdat Xcc infecteert via het blad werd behandelingen met FoX2 verder geëvalueerd in een bladbehandeling. In een eerste set-up werden de bacterie (GBBC1419) en faag gemengd in verschillende concentraties (107CFU/mL met 106, 107 en 108 PFU/mL, gesupplementeerd met 0.025% Silwet Gold uitvloeier) en gespoten over jonge wittekool plantjes (2 herhalingen, 3 planten per herhaling). Na toepassing van de bacterie-faagcocktail werden de planten 14 dagen geplaatst onder hoge luchtvochtigheid voor het scoren van de Xcc symptomen.
Deze proef toonde aan dat een spuitbehandeling aan MOI 10 (107CFU/ml bacterie en 108 PFU/ml FoX2) resulteert in significant minder aangetast bladoppervlak en in significant minder infecties per blad. Bladbehandelingen aan lagere MOIs zijn niet effectief.
In een tweede set-up werd een meer realistische situatie nagebootst door een faagbehandeling te doen alvorens de bacteriële infectie uit te voeren (ook via bespuiting aan 107 CFU/ml met 0.025% Silwet Gold). Dit werd in twee onafhankelijke herhalingen uitgevoerd met drie planten per conditie. Dit resulteerde in een symptoomreductie van 34% and 40% na een respectievelijke behandeling met MOI 10 en 100 (p = 0,0032 en 0,0008). Bij een MOI van 100 is er ook een significantie reductie van het aantal infectiepunten per blad (p = 0,0178).
Taak 4: Zaadbehandeling
Zaadbehandelingen prei
De effectiviteit van de KIL3b en KIL5 cocktail werd getest in een zaadbehandeling. Hiervoor werden preizaden (Rijkzwaan) na sterilisatie (5% hypochloriet) en droging (1u) artificieel besmet met CFBP 1770 (OD 0.1) gedurende 16u. Na drogen (3u) resulteerde dit in 108 CFU/g besmettingsgraad. Vervolgens werden de zaden geweekt in faagoplossing (109PFU/ml) en geïncubeerd gedurende 7 dagen in drie biologische herhalingen. Dagelijks werd de bacteriële concentratie in de zaden gemeten, alsook de faagconcentratie door 1 g zaad te homogeniseren in 1 ml PBS. Bacteriën werden gekwantificeerd op selectieve Pseudomonas P agar (Difco).
Uit deze test bleek dat de bacteriële concentratie in niet-faagbehandelde zaden vrij constant bleef op 108 CFU/g. Na faagbehandeling, daalde de concentratie 2 log eenheden tot ongeveer 106CFU/g. De faagconcentratie bleef ook vrij constant rond 107 PFU/g met een stijging op dag 2, dat aantoont dat er wel degelijk infectie en amplificatie is op de zaden. De zaden werden niet verder gekiemd.
Zaadbehandelingen kool
De effectiviteit van zowel FoX2 als FoX6 werd geëvalueerd op zowel artificieel als natuurlijk geïnfecteerde bloemkoolzaden (Giewont). In de eerste artificiële set-up werden de zaden eerst gesteriliseerd met 5% javel, gespoeld met steriel water en gedroogd gedurende 1u in een laminaire flow. Hierna werden de zaden geschud in bacterieoplossing (GBBC1412 of 1419) gedurende 2u en terug gedroogd, resulterende in een finale concentratie van 108 – 106– 104 CFU/g zaad. Hierna werden zowel steriele (controle) als geïnfecteerde zaden geweekt gedurende 18u op 16°C al dan niet in 108PFU/ml faagoplossing. De bacterie- en de faagconcentratie werden gevolgd door 0.3 g zaden te homogeniseren in 1 ml PBS (fosfaatbuffer) en uitplating op semi-selectief medium voor Xcc (briljant cresyl blue-starch medium) in 6-voud. De overige zaden werden steriel gezaaid in 1/4e Murashine en Skoog medium gesupplementeerd met 10 g/l phytagel en opgegroeid gedurende 14 dagen op 16°C en onder een 16/8 dag/nachtregime.
In de tweede set-up werden natuurlijk geïnfecteerde zaden (ter beschikking gesteld door een lid van de GG) behandeld met 108 PFU/ml fagen gedurende 18u en verder op dezelfde manier behandeld als de artificieel besmette zaden. De stam die deze zaden infecteerde werd eerst gevoelig getest op infectie met FoX2 of FoX6.
Er is steeds een duidelijke reductie van het aantal bacteriën na zaadbehandeling met FoX2 of FoX6. Deze reductie is het hoogste bij artificieel besmette zaden (108 CFU/zaad) met een 1,5 of een 1,7 log reductie. Een lagere bacteriële concentratie (106 of 104) leidt tot een lagere reductie. Bij natuurlijke geïnfecteerde zaden werd een 1 of een 1,2 log reductie geobserveerd na behandeling met respectievelijk FoX2 en FoX6.
Werkpakket 2: Kwaliteit van de faagcocktail optimaliseren Taak 1: Isoleren van resistente bacteriën, testen op kruisresistentie tegen verschillende fagen en virulentietesten
KIL fagen tegen Pspo
Het voorgaande LA traject resulteerde in 6 fagen specifiek voor Pspo: KIL1-5 en een H-mutant (een host range mutant die geëvolueerd werd om extra gastheren te herkennen) KIL3b die een iets groter bereik heeft dan KIL3 (Rombouts et al. Front. Microbiol. 2016, 7, 1–15).
Alle Pspo stammen in collectie zijn gevoelig aan KIL3b en/of KIL5. Samen hebben deze fagen dus een gastheerspectrum van 100%. Er werden in de loop van dit project geen natuurlijk resistente bacteriën geïsoleerd uit veldstalen. Wel werden er resistente stammen gemaakt voor de receptoranalyse (WP2 Taak 3, zie verder). Sommige resistente stammen zijn resistent tegen zowel KIL3b als KIL5, terwijl andere stammen geen kruisresistentie vertonen.
De transposon mutant in OX88_RS20865(coderende voor een membraaneiwit) werd getest voor zijn virulentie op prei. De bladeren van volwassen preiplanten van cultivar Krypton (Nunhems) werden hiervoor beschadigd met een naald. Vervolgens werd 100 µl bacteriesuspensie (108CFU/ml) geïnjecteerd in het blad (5 planten, 3 bladeren per plant). 10 dagen na infectie werd de lesielengte gemeten.
Ook werden er in het zaadbehandelingsrexperiment 4 bacteriën opgepikt die resistent waren aan KIL3b en KIL5. Deze werden gesequeneerd en een SNP analyse werd uitgevoerd (resultaten gepubliceerd in Holtappels et al., 2020; zie leverbaarheden). Deze mutanten vertonen ook puntmutaties in genen geassocieerd met LPS biosynthese. Hoewel de virulentie niet werd getest, kunnen we een verlaagde virulentie verwachten aangezien dit in literatuur al beschreven staat voor sommige van de gevonden LPS-mutanten (bv. wbpM, zie Creuzenet et al., Mol Microbiol2001, 41, 1295-1310).
FoX fagen tegen Xcc
Bij de start van dit LA project waren er al zeven fagen beschikbaar tegen Xcc: SoPhi1-7. Na herhaalde pogingen konden SoPhi5-7 niet gerecupereerd worden uit de beschikbare faagstocks, waaruit we konden besluiten dat deze fagen niet stabiel waren. In de loop van dit project werden drie nieuwe Xcc fagen geïsoleerd. Alle fagen werden hernoemd tot FoX1-7.
Op basis van hun genoomsequentie, kunnen de FoX fagen ingedeeld worden in 3 clades. De eerste groep bestaat uit FoX1, FoX2, FoX3 en FoX5. FoX4 vormt een aparte groep en FoX6 en FoX7 vormen een derde groep. De FoX1-achtige fagen vormen nieuwe faagspecies, verwant aan het Jilinvirus genus aangezien ze een vergelijkende genoomarchitectuur hebben. FoX4 vormt ook een nieuw faagspecies, van ver verwant met leden van hetSanovirus genus. FoX6 en FoX7 tenslotte zijn hetzelfde species als de reeds beschreven faag Carpasina.
Tussen 2011 (start voorgaande LA traject) en 2020 werden in totaal 68 verschillende Xcc stammen geïsoleerd van een diverse collectie aan Brassica spp. Alle Xcc stammen in collectie werden getest op gevoeligheid aan de verschillende FoX fagen. Hieruit bleek dat de FoX1-achtige fagen een parallel gastheerspectrum hebben aan FoX4, FoX6 en FoX7. Er zijn dus geen stammen beschikbaar die efficiënt door beide faagtypes kunnen worden geïnfecteerd. Als we enkel de lokaal geïsoleerde stammen in beschouwing nemen, kunnen FoX2 en FoX6 gezamenlijk 80% van de collectie infecteren. Er zijn een aantal resistente stammen beschikbaar. Om een idee te hebben van hoe onze Xcc collectie er uit ziet en of deze representatief is voor een bredere collectie werden 24 stammen (gevoelig of resistent aan de fagen) geselecteerd en geanalyseerd door whole genome sequencing. Deze sequenties werden gesupplementeerd met beschikbare Xcc genoomsequenties van NCBI en vervolgens werd een core genome analyse gedaan.
Een phylogenetische analyse van de data toont dat er 4 Xcc clusters zijn. Onze collectie bevat isolaten uit elk van deze clusters en is dus wel degelijk representatief. De FoX1-achtige fagen kunnen isolaten uit twee clusters infecteren, terwijl FoX4 en FoX6 isolaten uit de vier clusters kunnen infecteren. Onze collectie bevat resistente stammen uit twee clusters. Deze zijn steeds resistent tegen alle fagen.
Een aantal resistente GBBC1419 stammen bekomen uit de receptoranalyse (zie verder) werden geëvalueerd op hun virulentie en vergeleken met de wildtype GBBC1419. Enkel een mutant in een epimerase/dehydratase proteïne vertoont een significant lagere virulentie. De andere mutanten vertonen ook zichtbaar een lagere virulentie, zij het niet significant.
Taak 2: Isolatie van H-mutantenKIL fagen tegen Pspo
Aangezien alle Pspo stammen uit onze collectie kunnen geïnfecteerd worden door KIL3b en/of KIL5 was er geen noodzaak om een H-mutant te evoluëren.
FoX fagen tegen Xcc
In het begin van het project waren er enkele stammen resistent tegen de toen beschikbare fagen. In de loop van het project werd de faagcollectie aangevuld met een aantal nieuwe isolaties op resistente stammen. Maar er zijn nog steeds stammen die resistent zijn aan alle fagen. Tot nu toe konden hier geen fagen tegen worden geïsoleerd of geëvolueerd. Aangezien FoX2 en FoX6 gezamenlijk 80% van de collectie infecteren, werd verder gegaan met deze faagcocktail.
Taak 3: Faag receptoranalyse m.b.v. transposon mutageneseKIL fagen tegen Pspo
Tijdens de eerste biënnale werd de focus gelegd op de verdere moleculaire karakterisatie van de bacteriofagen uit de geselecteerde cocktail KIL3b en KIL5 om alzo een faagcocktail te hebben waarbij de kans op resistentieontwikkeling minimaal is. Een protocol gebaseerd op transposon mutagenese (details gepubliceerd in Holtappels et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 2930) leverde verschillende eiwitten op betrokken in biosynthese van LPS voor KIL3b, terwijl een hypothetisch membraaneiwit werd geïdentificeerd voor KIL5. LPS is dus waarschijnlijk de primaire receptor van KIL3b terwijl KIL5 mogelijks een membraaneiwit herkent als receptor.
Door complementatie van het dTDP-4-dehydrorhamnose reductase (gecodeerd door dhrr) of het membraaneiwit (gecodeerd door OX88_RS20865) en adsorptietesten werden deze receptoren bevestigd.
We kunnen bijgevolg besluiten dat KIL3b en KIL5 een andere receptor herkennen en dus complementair zijn in de cocktail met een lagere kans op resistentieontwikkeling.
FoX fagen tegen Xcc
Dezelfde techniek werd gebruikt om de receptor van FoX2 en FoX6 te identificeren. Voor beide fagen lijkt LPS de receptor te zijn. Voor FoX2 lijkt EPS (exopolysaccharide) een mogelijks secundaire receptor aangezien een mutant van het epimerase/dehydratase eiwit ook resistentie geeft tegen FoX2. De receptoren werden bevestigd als zijnde belangrijk voor adsorptie door een adsorptietest uit te voeren met fluorescent gekleurde fagen en vervolgens via microscopie de fluorescentie te kwantificeren. Voor beide fagen lijkt de wxc gencluster belangrijk te zijn voor faaginfectie.
Vervolgens toonden we aan dat variatie in de wxc gencluster (LPS biosynthese) verantwoordelijk is voor het parallelle gastheerspectrum van de FoX-fagen. De gencluster werd hiervoor geëxtraheerd uit de genoomdata (zie hierboven) en gebruikt voor een MLST analyse. De stammen splitsen mooi uit in de FoX1-gevoelige stammen en de FoX4/6-gevoelige stammen. Voor de faagcocktail tegen Xcc zal er dus steeds een combinatie nodig zijn van twee fagen die elk van deze groepen kunnen infecteren.
Taak 4: Verifiëren van transductiepotentieelEen protocol werd opgesteld om het transductiepotentieel van de verschillende fagen te testen. Hierbij werden fagen opgegroeid op een stam met een antibioticumresistentiemerker. Deze fagen werden vervolgens gebruikt om een antibioticumgevoelige stam te infecteren. De infectie werd gestopt en de bacteriën werden uitgeplaat op selectief medium. In het geval van de fagen van de twee cocktails (KIL3b – KIL5 en FoX2 – FoX6) werden geen resistente bacteriën teruggevonden. Dit gecombineerd met de sequencing data doet vermoeden dat deze fagen niet transduceren. Echter, er is geen positieve controle (een gekende transducerende faag) voor handen om de werking van het protocol te verifiëren.
Taak 5: Optimalisatie faagproductie en opzuiveringIn eerste instantie werd de productie van de fagen geoptimaliseerd door verschillende gastheren en incubatietijden te variëren. Zo werd de productie van de verschillende fagen geoptimaliseerd tot een productie van 1010 - 1012 pfu/ml.
Tijdens werkjaar 1 werd ook gefocust op de opzuivering van de KIL fagen voor Pspo met CIM anion-exchange chromatografie. De recovery voor deze fagen (hoeveel fagen die geladen worden ook effectief elueren) werd geoptimaliseerd en ligt tussen de 50 en 80% terwijl de capaciteit ligt tussen 1.109 tot 2.1011 fagen per ml kolomresin. Deze waarden zijn vergelijkbaar met wat tot nu toe in de literatuur werd beschreven.
Voor de FoX2 en FoX6 fagen van Xcc werd de FPLC opzuivering ook geoptimaliseerd met een DEAE anionenuitwisselaar. De maximale bindingscapacitiet van de twee fagen bedraagt 1.49x1012 PFU en 1.12x1013 PFU per ml resin voor respectievelijk FoX2 en FoX6. Na elutie blijven 74% van de FoX2 en 47% van de FoX6 partikels infectieus.
Deze opzuiveringen werden gebruikt om genoeg fagen te produceren voor alle bioassays en veldproeven.
Taak 6: Verifiëren van de faagstabiliteit en de invloed van additieven hieropDe stabiliteit van de fagen werd getest in verschillende pH en temperatuur condities. Zo werd een pH range van 3 tot 11 en een temperatuur range van 4°C tot 37°C getest. Hieruit is gebleken dat de fagen stabiel zijn in een range van pH 4 tot 10 en op alle geteste temperaturen voor een periode van twee weken. Verder werd de stabiliteit van de fagen getest in verschillende bladuitvloeiers: Silwet Gold veroorzaakt een kleine reductie in de concentratie van faag, Trend heeft een duidelijke negatieve invloed heeft op de faagstabiliteit, S70 en R11 hebben haast geen invloed. De fagen zijn stabiel genoeg om zo gebruikt te worden in de bioassays en veldproeven.
Werkpakket 3: Monitoring van bacterie- en faagpopulatie Taak 1: Bodembesmetting in kaart brengen
In dit werkpakket wordt de bacterie-en faagpopulatie in Vlaanderen in kaart gebracht door monitoring van besmette kool- en prei-percelen. In de eerste biënnale werden minder stalen van besmet plantenmateriaal en besmette bodem genomen dan voorzien in het projectvoorstel. Dit was te wijten aan de droge zomers. Een trend die zich in de daaropvolgende jaren heeft voortgezet, met slechts enkele meldingen van aantasting, welke na analyse niet allemaal Pspo of Xccbleken te zijn.
Tijdens de staalnames werd wel vastgesteld dat Xcc enkel aan of in de wortels van zieke koolplanten konden worden aangetoond en niet in de grond als dusdanig. Daarnaast bleek dat de detectie van Xcc in de grondstalen op semi-selectief medium een lage gevoeligheid vertoonde (ongeveer 106Xcc/gram).
Taak 2: Toetsen faagcocktail aan nieuwe Xcc en Pspo isolatenEen belangrijke taak in dit werkpakket is het toetsen van nieuwe isolaten van Xcc en Pspoaan deze verkregen in het IWT project 100881. Zo kan nagegaan worden of de bacteriepopulatie verandert met de tijd. Nieuwe introducties zijn mogelijk omdat de zaadteelt op verschillende geografische locaties in de wereld plaatsvindt. Er werden meerdere nieuwe isolaten van Xcc en Pspoverkregen uit diagnostische kool- en preimonsters die werden aangeleverd door de praktijkcentra in het project. In de DNA barcode gyrB werden voor Xcc genetische verschillen aangetoond. In de DNA barcode rpoD voor Pspo werden geen genetische verschillen aangetoond. Eveneens werd getest of de bij de projectstart beschikbare fagen de nieuwe bacterie-isolaten konden infecteren. Hieruit is gebleken dat tien van de dertien nieuwe isolaten konden gelyseerd worden door de toenmalige Xcc fagen in collectie. Dit onderstreept het belang om continue faagscreenings uit te voeren zodat de faagcocktail up to date blijft. De faagcocktail werd verder uitgebreid en gekarakteriseerd.
Taak 3: Screening faagpopulatieTenslotte gebeurde in dit WP ook een screening van de faagpopulatie. Indien mogelijk werd bij elk plantenstaal aangetast door bacterieziekte ook een bodemstaal geanalyseerd op aanwezigheid van fagen. Er werden vier nieuwe FoX fagen geïsoleerd die effectief blijken te zijn tegen enkele resistente stammen (GBBC 3217 – GBBC 3236 – GBBC 3228). Deze fagen werden toegevoegd aan de bestaande faagcocktail.
Werkpakket 4: Implementatie & disseminatie
Het doel van dit werkpakket was enerzijds een brede bewustmaking over bacteriofagen als ecologisch verantwoorde bestrijder en anderzijds de instructie over praktijktoepassing. Gedurende de 1ste biënnale werden al stalen genomen bij groentetelers die kampen met bacterieziekte ter monitoring van de bacterie- en faagpopulatie en ter uitbreiding van de faagcocktail. Aan deze telers werd bijgevolg ook advies gegeven over preventieve en hygiënische maatregelen. Dit werd verdergezet tijdens de tweede biënnale, hoewel het aantal meldingen van aantasting zeer laag is gebleven. Door de lage ziektedruk kon de mijlpaal van 450 adviezen helaas niet bereikt worden.
In de laatste biënnale werd sterk ingezet op demonstratieproeven op de praktijkcentra, dit zowel in prei als kolen. Door de droge zomers was het moeilijk om, ondanks kunstmatige infectie, aantasting te verkrijgen in de preiproeven. Hieruit konden daarom geen resultaten bekomen worden. In 2017 hebben we wel twee kleine proeven kunnen aanleggen op een praktijkveld met natuurlijke infectie. Daar kon reeds positief effect vastgesteld worden van de toepassing van de faagcocktail (KIL3b + KIL5), in combinatie met Silwet Gold, op de aantasting. De veldproeven in kolen waren meer succesvol. Daarvoor werd gewerkt met een kunstmatige infectie, door verneveling van een bacteriesuspensie (106 cfu/ml) over het gewas. In 2018 werd voor het eerst ook ingezet op preventieve toepassingsmethoden, welke veelbelovend bleken. De daaropvolgende jaren werden deze dan ook aangelegd in de veldproeven. In 2019 werden enkel in Sint-Katelijne-Waver goede resultaten bekomen, waar opnieuw een preventieve methode, daar fytodrip met faagcocktail (108 pfu/ml), werkzaam bleek. Tijdens het laatste projectjaar werd een combinatie van fytodrip, plantbakbehandeling en aangieten met de faagcocktail (FoX2 + FoX6) (108 pfu/ml) (wekelijks of driewekelijks) uitgetest, naast een gewasbespuiting van de faagcocktail met CaCl2. Hoewel aangieten uit eerder onderzoek (met jonge plantjes) potentieel leek te hebben, waren het de gewasbespuitingen die voor significante reducties konden zorgen, zowel op het PCG als PSKW. Waarschijnlijk had de invloed van de grootte van de planten en de weersomstandigheden een effect negatief effect op de aangietmethode. Positieve effecten van het aangieten werden wel waargenomen bij Inagro en PSKW. Daarnaast werd dan weer verwacht dat de toevoeging van CaCl2 een verbeterde faagadsorptie op de bacteriën verzorgd, wat in de resultaten zichtbaar was.
In de loop van het project verschenen verschillende artikels (o.a. in Landbouwleven, Proeftuinnieuws, etc.) en werd informatie van het project naar de academische wereld verspreid via presentaties op symposia. Zo werd het project o.a. voorgesteld op het Viruses of Microbes congres aan de Universiteit van Wroclaw (Polen), de Evergreen Phage meeting aan de Evergreen State College (Olympia, WA, USA); de Oxford phage meeting (Oxford, UK), het Biocontrol 2019 congres (Vitterbo, Italië), het symposium on Crop Protection aan de Ugent, aan de KU Leuven tijdens de 1st Plant-Microbe Interaction day, VIROPLANT meeting en A2H Symposium. Op 5 september 2018 werden ruim 200 bezoekers van het Internationaal Koolcongres rondgeleid op het koolplatform van Inagro waar ze een toelichting kregen rond het bacteriofaag onderzoek. Via rondleidingen op de verschillende praktijkcentra werden ook al heel wat uit de fytowereld en studenten geïnformeerd over het project en de problematiek in kolen en prei.
Op Plattelandspret (tvoost) werd een korte reportage gemaakt over het project, waarbij verschillende aspecten van het onderzoek werd aangehaald (veldproeven, bioassays, labo-onderzoek). Aflevering 22, 2/11/2019: https://www.tvoost.be/programmas/plattelandspret-plattelandspret-afl-22-2019-87460
Er werden vier artikels in vaktijdschriften gepubliceerd:
- Preventieve faagbehandeling loont in de strijd tegen bacterieziekten (Proeftuinnieuws 4, 22/02/2019)
- Virussen op het veld zijn geen science-fiction (KU Leuven, Departement Biosystemen, 27/02/2020)
- Virussen kunnen gewassen beschermen (Boer&Tuinder, 12/03/2020)
- Bacterieziekten onderdrukken met fagen weer een stap dichterbij (Proeftuinnieuws 19, 6/11/2020)
Volgende wetenschappelijke artikels werden reeds gepubliceerd. Het artikel over Xcc is klaar om ingediend te worden:
- Holtappels, D., Lavigne, R., Huys, I. en Wagemans, J. Protection of phage applications in crop production: a patent landscape. 2019. Viruses, 11, 277; doi: 10.3390/v11030277
- Holtappels, D., Kerremans, A., Busschots, Y., Van Vaerenbergh, J., Maes, M., Lavigne, R. en Wagemans, J. Preparing for the KIL: receptor analysis of Pseudomonas syringae pv. porri phages and their impact on bacterial virulence. 2020. International Journal of Molecular Sciences, 21, 2930; doi: 10.3390/ijms21082930
- Akremi, I., Holtappels, D., Brabra, W., Jlidi, M., Hadj Ibrahim, A., Ben Ali, M., Fortuna, K., Ahmed, M., Van Meerbeek, B., Rhouma, A., Lavigne, R., Ben Ali, M. en Wagemans, J. First report of filamentous phages isolated from Tunisian orchards to control Erwinia amylovora. 2020. Microorganisms, 8, 1762; doi: 10.3390/microorganisms8111762
- Holtappels, D., Fortuna, K., Lavigne, R. en Wagemans, J. The future of phage biocontrol in integrated plant protection for sustainable crop production. 2021. Current opinion in Biotechnology, 68: 60-71.
- Holtappels, D., Fortuna, K., Moons, L., Broeckaert, N., Bäcker, L., Vennemand, S., Rombouts, S., Lippens, L., Baeyen, S., Pollet, S., Noben, J.P., Oechslin, F., Vallino, M., Aertsen, A., Maes, M., Van Vaerenbergh, J., Lavigne, R. en Wagemans, J. Development of an integrated pest management strategy to control Xanthomonas campestris pv. campestris based on bacteriophages. Ready for submission.
Werkpakket 5: Wetgeving & intellectuele bescherming Taak 1: Europese erkenningsprocedure voor bacteriofagen verduidelijken
Om faagtherapie op een veilige manier toe te passen, is een wettelijk kader nodig. Regelgeving is hierbij een grote uitdaging. Het eerste doel van dit werkpakket was de erkenningsprocedure verduidelijken.
In de Europese commissie zijn nog geen faagproducten op de markt zijn, m.u.v. een Hongaars product ‘Erwiphage Plus’ tegen Erwinia amylovora infecties bij appel en peer dat enkel lokaal toegelaten is tijdens een bepaalde bloeiperiode (dient elk jaar terug goedgekeurd te worden). Dit valt dan onder een noodprocedure waarbij een lidstaat van de EU zelf een tijdelijke authorisatie kan goedkeuren.
Na overleg met GAB (een Europees bedrijf die registratie van plant protection products begeleid) werd duidelijk dat faaggebaseerde (bio)pesticides momenteel wel degelijk onder dezelfde wetgeving vallen als andere plant protection products (PPPs) en dus ook hieraan moeten voldoen (de PPP regulation (EC) 1107/2009). Dit wil zeggen dat net zoals voor chemische pesticiden eerst de actieve bestanddelen moeten worden goedgekeurd door de Europese Commissie alvorens een finaal PPP kan worden geauthoriseerd in de verschillende lidstaten. De Europese Commissie wordt voor de goedkeuring van actieve stoffen geinformeerd door de verschillende lidstaten en door EFSA (European Food Safety Authority). Om een actieve stof te laten goedkeuren moet de veiligheid (voor mens, dier en omgeving) ervan aangetoond worden.
Eens de actieve stof is goedgekeurd, dan geldt dit voor 10-15 jaren. Het dossier dat moet worden ingediend volgt wetgeving (EU) 283/2013. Het ingevulde dossier wordt doorgestuurd naar een lidstaat (‘de Rapporteur Member State/RMS’) die het dossier ontvankelijk verklaart en een voorlopig rapport voorbereid voor EFSA die vervolgens een peer review uitvoert en een conclusie formuleert voor de ‘Standing Committee for Food Chain and Animal Health’ van de Europese Commissie. Dergelijk proces duurt minstens ongeveer 3,5 jaar. In de Europese Unie zijn er momenteel 7 virus-gebaseerde actieve bestanddelen al goedgekeurd (voornamelijk baculovirussen en geattenueerde plantvirussen.
Enkele andere bestanddelen zijn nog in aanvraag. Een belangrijke opmerking bij fagen als actieve bestanddelen is dat deze kunnen vallen onder de ‘low risk substances’ net zoals andere biologicals. De voordelen zijn dat een lagere hoeveelheid efficacy trials nodig zijn, er een ‘fast-track’ authorisatie procedure mogelijk is, en dat deze bestanddelen ineens zijn goedgekeurd voor 15 jaar ipv 10 jaar. Ook is er een langere protectie op de veiligheidsstudies (13 jaar ipv 10 jaar), zodat je producten langer IP-gewijs beschermd zijn van reproductie door een concurrent.
Eens elk actief bestanddeel is goedgekeurd, dan kan het PPP aanvraagdossier worden opgesteld volgens wet (EU) 284/2012. In dit dossier wordt niet meer geoordeeld over de veiligheid, maar het gebruik (welke gewassen, hoeveelheid van applicatie, …) dient verduidelijkt te worden. Productregistratie gebeurd in zones van de EU (Noord, Centraal en Zuid), waarbij terug 1 lidstaat per zone wordt gekozen om het dossier in te dienen.
Enkele specifieke aandachtspunten voor faagcocktails als PPP: fagen hebben een nauw gastheerspectrum, een faagcocktail is daarom absoluut nodig. Die faagcocktail is één van de pijnpunten om faagproducten als PPP te laten erkennen. Tijdens de 1ste GG kwam de vraag naar identiteit: ‘Hoe sterk lijken fagen op elkaar?’. Taxonomie van fagen is de verantwoordelijkheid van het ‘Bacterial and Archaeal Viruses Subcommittee’ (onderdeel van het ‘International Committee on the Taxonomy of Viruses’). Momenteel wordt een faagspecies gedefinieerd als zijnde identiek aan een ander virus als deze fagen op DNA-niveau minstens 95% gelijkenis vertonen (Adriaenssens en Brister, 2017). Deze regel zal enorm belangrijk zijn voor de registratie van een faagspecies als actieve stof in een biopesticide. Fagen die minder dan 5% verschillend zijn op basis van hun genoom, maar eventueel wel voldoende verschillend zijn om een ander gastheerspectrum te hebben (dit kan bijvoorbeeld enkel door enkele puntmutaties in hun staartvezelgenen), zullen immers als 1 actieve stof dienen te worden geregistreerd. Ook als de fagen in het product door de jaren heen lichtjes evolueren door natuurlijke evolutie op hun gastheer, valt deze faag nog steeds onder hetzelfde registratiedossier zolang er minder dan 5 nucleotiden op 100 nucleotiden verschil is met het originele product.
We ondervinden duidelijk dat faagtherapie in beweging is in Europa, in diverse sectoren. Dit wordt dan ook verder opgevolgd binnen andere faagonderzoeksprojecten (H2020 VIROPLANT, Era-Net ANIHWA, JPI-AMR AntiBio-Lab, samenwerking met brandwondencentrum, etc.).
Taak 2: Mogelijkheden voor intellectuele bescherming verduidelijkenHet tweede doel van dit werkpakket was de patenteerbaarheid van faag-gebaseerde producten in de landbouw verduidelijken. KULeuven heeft hierover een artikel gepubliceerd om dit te doen. De belangrijkste punten die bevonden:
- 49 patentfamilies rond fagen voor gewasbescherming werden geïdentificeerd in patentdatabanken, met een stijgend aantal patenten de laatste jaren (laatste update op 17/2/2019)
- Deze stijging loopt samen met het stijgende aantal wetenschappelijke publicaties
- De meeste patenten worden ingediend door non-profit organisaties uit Azië
- Goedgekeurde patenten lijken eerder brede claims te hebben (b.v. ze claimen fagen in het algemeen voor een bepaalde toepassing ipv een specifieke faag) en gaan meestal over de applicatiemethode
Alle bevindingen kunnen uitgebreid nagelezen worden in Holtappels et al. Viruses 2019, 11, 277.
Naast de mogelijkheid die er wel degelijk is om een faagcocktail of het gebruik ervan te patenteren, is de procedure zoals besproken onder taak 1 ook een bescherming voor het bedrijf dat een faagcocktail wil commercialiseren. De verschillende studies die gebeuren voor een actieve stof dossier zijn immers ook beschermd voor de aanvrager gedurende 10 jaren (of 13 jaar voor biologicals). Hierdoor kan een concurrent enkel een product met de goedgekeurde fagen op de markt brengen als deze een licentie betaald aan de aanvrager van het actieve stof dossier. Dit biedt dus een extra bescherming.