Profilering met hoge resolutie van orale biofilms: van toolbox ontwikkeling tot nieuwe behandelingsanalyse voor parodontitis

Parodontitis is een multifactoriële chronische ontstekingsziekte in de mondholte die geassocieerd wordt met de accumulatie van micro-organismen in een biofilm. Het bestuderen van deze complexe gemeenschappen onder gecontroleerde condities vereist experimentele biofilm modelsystemen die de natuurlijke omgeving zo goed mogelijk nabootsen. Het doel van dit onderzoeksproject is de ontwikkeling van een multispecies parodontaal model dat representatief is voor parodontitis, de continue stroom van voedingsstoffen aan het lucht-vloeistof oppervlak in de mondholte nabootst en gebruikt kan worden om mechanistisch inzicht te krijgen in nieuwe behandelingsmethoden (met name pre- en probiotica) door het toepassen van een profilering in de tijd en ruimte.

De multispecies parodontale gemeenschap bestaat uit vijf belangrijke bacteriën die geassocieerd worden met parodontitis, waarvan er vier fluorescent gelabeld zijn; Streptococcus gordonii GFPmut3*, Streptococcus oralis GFPmut3*, Streptococcus sanguinis pVMCherry, Fusobacterium nucleatum en Porphyromonas gingivalis SNAP26. Deze werden gekarakteriseerd in individuele en gecombineerde bioreactor experimenten met betrekking tot hun groei en metabolisme. Aanzienlijke inspanningen werden geleverd om een betrouwbare analyse te ontwikkelen van vrije en eiwitgebonden aminozuren en van het productiepotentieel van waterstofperoxide. Op basis van alle resultaten werd een interactienetwerk opgesteld dat competitieve, coöperatieve en inhiberende interacties tussen de bacteriën van de gemeenschap aangeeft. Deze interspecies interacties werden weerspiegeld in een continu bioreactor experiment, waarbij alle bacteriën van de gemeenschap quasi constante concentraties bereikten, behalve Porphyromonas gingivalis SNAP26 als gevolg van competitie voor peptiden.

De parodontale gemeenschap werd opgegroeid in een opnieuw ontworpen druppelstroom biofilmreactor om de continue stroom van voedingsstoffen aan het lucht-vloeistof oppervlak in de mondholte na te bootsen. Het ontwerp maakte realtime karakterisering mogelijk. De biofilm in de reactor ontwikkelde zich tot een heterogene, ruimtelijk uniforme, compacte en metabolisch actieve biofilm met relatieve cel aantallen die vergelijkbaar zijn met die van een gezond individu. De metabolische activiteit, structurele eigenschappen en bacteriële samenstelling van de biofilm bleven stabiel van 3 tot 6 dagen. Als proof of concept voor ons parodontaal model werd de 3 dagen gegroeide, stabiele biofilm blootgesteld aan een prebiotische behandeling met L-arginine. De veelzijdige effecten van L-arginine op de orale biofilm werden gevalideerd in deze modelopstelling. Daarnaast werd L-arginine slechts tijdelijk blootgesteld aan de stabiele biofilm alsook toegevoegd aan een biofilm in ontwikkeling. Hoewel L-arginine consequent de groei en incorporatie van de pathogene bacteriën remde, werden reducties in de dikte en het volume van de biofilm alleen waargenomen bij behandeling van stabiele biofilms en herstelde de biofilm zich snel na behandeling. Als zodanig toonden we aan dat de invloed van L-arginine op de parodontale biofilm slechts tijdelijk is en afhankelijk van een complexe wisselwerking tussen de toestand van de biofilm en de beschikbare voedingsstoffen.

Particle tracking is een nieuwere micro-reologische techniek bij biofilmonderzoek dat in dit project werd gebruikt om de mechanische structuur van de biofilm en de invloed van L-arginine hierop te karakteriseren. In de druppelstroom biofilmreactor ontwikkelde de parodontale biofilm zich snel tot een stijve, compacte biofilm, gekenmerkt door een grote overvloed aan immobiele deeltjes. Hoewel L-arginine het potentieel leek te hebben om de mechanica te destabiliseren en de hoeveelheid extracellulaire polymere stoffen te verminderen, waren de effecten minimaal en dus tegenstrijdig met bestaande literatuur. Dit werd waarschijnlijk veroorzaakt door de vorming van een biofilm onder schuifspanning, waardoor biofilms ontstaan die moeilijker te beïnvloeden zijn. Als zodanig benadrukte dit werk het belang van werken met stromingssystemen wanneer mechanica ertoe doet.

Om de verzameling van karakterisering technieken uit te breiden, werd een high-throughput telmethode uitgewerkt, gebruik makend van flowcytometrie. In zelf samengestelde en echte gemeenschapsstalen voorspelde de combinatie van flowcytometrie en CellScanner nauwkeurig de individuele, bacteriële aantallen in de gemeenschap. Door gebruik te maken van sonicatie om bacteriële ketens op te breken, werd de kwantificering voor de streptokokken aanzienlijk verbeterd. Aangezien sonicatie geen invloed had op de fluorescentie eigenschappen van de streptokokken, stelden we een workflow voor om sonicatie, flowcytometrie en CellScanner te combineren voor toekomstige gemeenschapsexperimenten.

In het algemeen toonde dit werk het belang en de relevantie aan van het ontwikkelde parodontale biofilmmodel voor het bestuderen van dynamische behandelingseffecten. Een reeks karakterisering technieken werd vertaald naar het modelsysteem om informatie in de tijd en ruimte te verkrijgen. De combinatie van het model en karakterisering toolbox kan verder benut worden om de algemene kennis van parodontitis te vergoten en de effectiviteit aan te tonen van nieuwe behandelingsmethoden, zoals pre- en probiotica, die zich richten op het behoud van een gezonde toestand.