Biocontrole en anti-biofilm moleculen ter bestrijding van rhizogene agrobacteriën in de tomatenteelt (BARATOM). (BARATOM)

In de afgelopen jaren is het probleem van gekke wortels in Vlaanderen sterk toegenomen. Bevragingen uitgevoerd bij Vlaamse tomaten-, komkommer- en auberginetelers toonde aan dat het percentage van besmette bedrijven gestegen is van 8% in 2011 en recent tot 25%. Dit geeft aan dat de ziekte zeer snel uitbreiding vindt. Dezelfde trend is waargenomen in diverse Europese landen, waarbij in Nederland en Frankrijk respectievelijk ongeveer 50% en 70% van de bevraagde bedrijven aangetast zijn, wat duidelijk de ernst van het probleem illustreert. Bovendien hebben we hier ook te maken met een zeer persistente ziekte: eens een bedrijf besmet is blijkt het heel moeilijk te zijn om van de ziekte af te geraken. Recent onderzoek heeft intussen aangetoond dat deze persistentie te wijten is aan het feit dat Agrobacterium zich kan nestelen in de biofilms van irrigatieleidingen, waardoor deze pathogeen beschermd wordt tegen desinfectiemiddelen die toegepast worden door de teler. Bovendien is gebleken dat bij Vlaamse tomatentelers die te kampen hebben met gekke wortels, verschillende types (stammen) van rhizogene Agrobacteriën werden teruggevonden. Bovendien verschillen deze stammen vaak sterk van elkaar op vlak van enkele relevante eigenschappen zoals biofilmvormend vermogen of catalase activiteit. Dit maakt een oplossing voor gekke wortels nog complexer dan aanvankelijk gedacht. Sommige stammen zijn bijvoorbeeld zeer resistent tegen waterstofperoxide, wat courant gebruikt wordt als ontsmettingsmiddel door tomatentelers, maar andere stammen zijn dan weer relatief gevoelig. Gezien de sector het gebruik van chloorhoudende desinfectiemiddelen eerder wil vermijden en peroxide niet altijd effectief lijkt, is een andere aanpak nodig om tot een duurzame beheersingsstrategie te komen. Daarom willen we in dit project twee vernieuwende pistes verder onderzoeken. Enerzijds willen we Agrobacterium bestrijden met behulp van biocontrole-organismen (BCO’s). In recent onderzoek hebben preliminaire experimenten op laboschaal aangetoond dat bepaalde bacteriële stammen een antagonistische activiteit vertonen tegen Agrobacterium. Het werkingsmechanisme en de effectiviteit op laboschaal zijn echter nog onvoldoende gekend. Verder onderzoek om deze bacteriële stammen in te zetten in de bestrijding van gekke wortels is dus absoluut vereist. Anderzijds willen we ons in dit project ook richten op de biofilmvorming die ervoor zorgt dat Agrobacterium zich in een beschermde niche nestelt, waardoor courant gebruikte desinfectietechnieken, zoals peroxidebehandeling of ECA-water, slechts een zeer beperkt effect hebben. Meer concreet zullen we de effectiviteit van nieuwe anti-biofilm moleculen verder onderzoeken. Partner CMPG heeft de afgelopen tien jaar een ruim portfolio opgebouwd van in house ontwikkelde anti-biofilm moleculen, waarvan de effectiviteit tegen Agrobacterium biofilms nog niet is onderzocht.

RESULTATEN:

WP1: Optimalisatie van het gebruik van BCO’s in de bestrijding van Agrobacterium biofilms op pilootschaal

In dit werkpakket werd het gebruik van in eerder onderzoek geïdentificeerde BCO’s geoptimaliseerd voor de bestrijding van gekke wortels. Initieel werd de vereiste verhouding van BCO ten opzichte van Agrobacterium geëvalueerd in microtiterplaat testen bepaald. De resultaten tonen aan dat de optimale verhouding BCO:agrobacterium een 5:1 verhouding bedraagt. Bijkomende factoren, zoals de invloed van het groeimedium en het toedienen van calcium werden ook onderzocht in microtiter plaat testen. De resultaten toonden aan dat groeimedium en toediening van calcium de antagonitsische activiteit van de BCO’s tegen Agrobacterium verhogen. Op pilootschaal experimenten werd er ook nagegaan of BCO’s de vorming van Agrobacterium biofilms tegen werkten, maar de BCO’s bleken slechts voor een beperkte inhibitie van biofilmvorming te zorgen.

WP2: Evaluatie en optimalisatie van de toepassingsmethode van BCO’s in de bestrijding van gekke wortels in semi‐praktijkomstandigheden

In dit werk pakket werd de applicatie van BCO’s voor de bestrijding van rhizogene agrobacteriën verder geoptimaliseerd in praktijkomstandigheden. In een preliminaire studie werd aangetoond dat door het toedienen van een mengsel van twee Paenibacillus xylanexedens stammen de incidentie van Agrobacterium sterk gereduceerd werd ten opzichte van de onbehandelde controle (Vanlommel et al., 2020). Bovendien werd er tijdens het uitvoeren van het project een additionele Bacillus sp. stam gevonden die ook antagonistische activiteit vertoonde. Twee serreproeven, georganiseerd in opeenvolgende jaren (2019 en 2020) werden opgesteld om na te gaan of een mengsel van BCO’s voordelen had, op welke wijze en frequentie de BCO’s best geïntroduceerd worden aan de planten alsook de concentratie van BCO’s die benodigd waren om succesvolle resultaten te behalen (Vargas et al., 2021a). Deze bevindingen werden verder onderzocht in teeltproeven uitgevoerd in 2021 en 2022, waarbij de applicatie van BCO’s werd vergeleken met commerciële producten, alsook de manier waarop de BCO’s werden aangebracht, hetzij in de vorm van een bacteriële suspensie, alsook in gevriesdroogde vorm, wat applicatie in de praktijk substantieel vergemakkelijkt. De bevindingen tonen aan dat de resultaten afhankelijk zijn van de toegediende concentratie BCO’s, en de frequentie van de applicatie van de BCO’s. De conclusie werd gesteld dat de toediening van de BCO’s een significante daling van geïnfecteerde planten met gekke wortels teweegbracht. De bevindingen die gedaan werden tijdens het project werden gedissemineerd in proeftuinnieuws artikels, alsook in wetenschappelijke publicaties (Vargas et al., 2021a; Vargas et al., 2021b). Het gebruik van de BCO’s in dit project heeft ook al interesse uit de industrie gekregen voor commercialisatie. Een kostenanalyse had ook aangetoond dat het gebruik van BCO’s ook uiterst economisch haalbaar is voor telers.

WP3 en WP4: Evaluatie van nieuwe anti‐biofilm moleculen op labo‐, pilootschaal en praktijkomstandigheden

In deze werkpakketen werden verschillende potentiële antibiofilm-moleculen geëvalueerd op hun potentieel om biofilmvorming te voorkomen. Deze veelbelovende antibiofilm-moleculen werden op pilotschaal getest, waarbij enkele problemen werden ondervonden, waaronder de synthese van grote hoeveelheden componenten, de oplosbaarheid van de componenten in water en ongewenste schuimvorming door het component tijdens waterrecirculatie. Nadat deze problemen waren verholpen, konden de eerste pilotschaal experimenten worden uitgevoerd. De initiële resultaten toonden aan dat de toevoeging van antibiofilm-componenten de aanwezigheid van Agrobacterium-biofilm met 1 tot 2 log kon verminderen.

In werkpakket vier werden de twee meestbelovende antibiofilm-componenten geselecteerd en geëvalueerd in glastuinbouw experimenten tijdens de teelt en tussen teelten. Verschillende experimenten werden opgezet om de omstandigheden te evalueren waarin deze antibiofilm-moleculen worden gebruikt, zoals fytotoxiciteit, oplosbaarheid, combinatie met H2O2 en de effecten van antibiofilm-moleculen bij testen tijdens en tussen teelten. De resultaten waren veelbelovend, met een aangetoond potentieel van antibiofilm-moleculen om gekke wortels te voorkomen. Voor het effectieve gebruik van deze antibiofilm-moleculen zal hun optimale werking alleen worden bereikt wanneer er bij de start van toediening geen biofilms aanwezig zijn, aangezien bestaande biofilms niet kunnen worden afgebroken. Het onderzoek dat verricht werd gedurende WP3 en WP4 resulteerde in verschillende publicaties in Proeftuinnieuws en in wetenschappelijke tijdschriften (Dieltjens et al., 2020; Pertusati et al., 2020; Jacobs et al., 2021).

WP5: Evaluatie van additieve effecten bij combinatie van biocontrole, antibiofilmtechnologie en klassieke desinfectie: naar een geïntegreerde beheersingsstrategie

WP5 onderzocht mogelijke additieve effecten van gecombineerd gebruik van BCO’s en antibiofilm-moleculen op hun bestrijding van gekke wortels gedurende serre proeven. De resultaten toonden een significant verschil met de positieve controle van enkel geïnfecteerde planten met een daling van 44% naar 27% met alleen BCO en 23% met BCO en antibiofilm moleculen. Het verschil tussen de combinatie van de anitbiofilm moleculen en BCO en enkel BCO leverde geen significante verschillen op, al lijkt er een positieve correlatie te zijn tussen de twee. Verder onderzoek naar de complementaire werking van de twee producten is nodig om dit additieve effect verder te exploiteren.

WP6: Verspreiding van projectresultaten

Een van de doelstellingen van dit project was om de algmene kennis omtrent Agrobacterium en de beheersing van gekke wortels breed te verspreiden onder de doelgroep. Naar aanleiding van de projectresultaten werden in de afgelopen periode 7 artikels gepubliceerd in wetenschappelijke peer-reviewed tijdschriften. Dit maakt dat we de doelstelling van 3 wetenschappelijke papers ruimschoots bereikt hebben. Daarnaast waren er 5 publicaties in vaktijdschriften, met 1 in voorbereiding voor 2023 (verslag van de studiedag in proeftuinnieuws, zie hieronder). De projectresultaten werden eveneens verspreid op diverse wetenschappelijke congressen aan de hand van diverse posters en lezingen. Een overzicht van de publicaties kan hieronder teruggevonden worden. Een lijst van posters en lezingen kan bezorgd worden op aanvraag.

Tot slot werden de projectresultaten ook gecommuniceerd op een afsluitende studiedag, georganiseerd in februari 2023. Het programma werd breed verspreid (zie bvb op https://www.kvcv.be/nl/activiteiten-en-nieuws/externe-activiteiten/3478-studiedag-gekke-wortels). In totaal hebben er 70 personen deelgenomen aan de studiedag, die afgesloten werd met een klein netwerking event.

Publicaties in wetenschappelijke tijdschriften:

• Vanlommel W., Moerkens R., Bosmans L., Lievens B., Rediers H., Wittemans L., Van Calenberge B., Paeleman A., Van Kerckhove S. (2020). Management of hairy root disease in protected tomato crops: a biological and chemical approach. Acta Hortic. 1269, 41-50. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2020.1269.6

• Dieltjens L., Appermans K., Lissens M., Lories B., Kim W., Van der Eycken E., Foster K.R., Steenackers H. (2020). Inhibiting bacterial cooperation is an evolutionarily robust anti-biofilm strategy. Nat Commun. 11:107. https://doi.org/10.1038/s41467-019-13660-x

• Jacobs L., Meesters J., Parijs I., Hooyberghs G., Van der Eycken E.V., Lories B., Steenackers H.P. (2021). 2-Aminoimidazoles as potent inhibitors of contaminating brewery biofilms. Biofouling. 37(1), 61-77. https://doi.org/10.1080/08927014.2021.1874366

• Pertusati F., Pileggi E.,  Richards J., Wootton M., Van Leemputte T.,  Persoons L.,  De Coster D., Villanueva X., Daelemans D., Steenackers H., McGuigan C., Serpi M. (2020). Drug repurposing: phosphate prodrugs of anticancer and antiviral FDA-approved nucleosides as novel antimicrobials.  J Antimicrob Chemother. 75(10), 2864-2878. DOI: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa268

• Vargas P., Van Kerckhove S., Van Calenberge B., Bosmans L., Lievens B., Rediers H. (2020). First Report of Hairy Root Disease, Caused by Rhizogenic Agrobacterium Biovar 1, in Hydroponic Bell Pepper Crop in South Korea. Plant Disease. 104(3), 968. https://doi.org/10.1094/PDIS-08-19-1719-PDN

• Vargas P., Bosmans L., Van Kerckhove S., Van Calenberge B., Raaijmakers J.M., Lievens B., Rediers H. (2021a). Optimizing Biocontrol Activity of Paenibacillus xylanexedens for Management of Hairy Root Disease in Tomato Grown in Hydroponic Greenhouses. Agronomy. 11:817. https://doi.org/10.3390/agronomy11050817

• Vargas P., Bosmans L., Van Calenberge B., Van Kerckhove S., Lievens B., Rediers H.               (2021b). Bacterial community dynamics of tomato hydroponic greenhouses infested with hairy root disease. FEMS Microbiol Ecol. 97:fiab153. https://doi.org/10.1093/femsec/fiab153

Publicaties in vaktijdschriften:

• Bosmans L., Van Calenberge B., Wittemans L., Vargas P., Steenackers H., Jostiakova B., Van Kerckhove S., Rediers H. (2020). Biocontrole-organisme als oplossing tegen gekke wortels.  Proeftuinnieuws. 6, 22-23.

•Bosmans, L., Vanlommel, W., Van Calenberge, B., Van Kerckhove, S., Paeleman, A., Vargas, P., Steenackers, H., Rediers, H (2018). Gekke wortels beheersen met anti-biofilm moleculen en door biologische controle. Proeftuinnieuws. 13, 13.

• Bosmans, L., Van Assche A., Wittemans L., Vasseur Coronado M., Van Kerckhove, S., Vargas, P., Coppola G., Steenackers, H., Rediers, H (2021). Na biocontrole-organismen nu ook anti-biofilmmolecule effectief tegen gekke wortels. Proeftuinnieuws. 19, 24-26.

• Rozendaal J., interview met Hans Rediers en Ado Van Assche (2022). Biocontrole-organisme blijkt efficiënt in bestrijding overmatige wortelgroei. Onder Glas 2.

• Bosmans L., Van Assche A., Wittemans L., Coppola G., Steenackers H., Goyens I., De Knijf A., Rediers H. (2022). Biocontrole organisme en anti-biofilm molecule bestrijden samen gekke wortels. Proeftuinnieuws. 20, 9-11.