Calcium regelt de intrinsieke dynamiek van Type 3 Translocase-exportpoort om clientsecretie te schakelen

Het type drie secretiesysteem (T3SS) is een multiproteïne (20-30) transmembraancomplex dat door Gram-negatieve organismen wordt gebruikt om bacteriële cytoplasmatische eiwitten af te leveren aan het cytoplasma van de gastheercel. De aanmaak en uitscheiding via de T3SS wordt heel precies geregeld door de bacteriecel. De T3SS is een zeer belangrijk virulentiemechanisme voor veel pathogene organismen. Dit systeem is de afgelopen drie decennia over de hele wereld bestudeerd, maar sommige aspecten van dit systeem moeten nog worden onthuld.

          Het hoofddoel van dit proefschrift was het begrijpen van het mechanisme van T3SS-secretieregulatie in enteropathogene Escherichia coli (EPEC) (3e hoofdstuk). Terwijl we in deze richting werkten, voelden we de behoefte aan een snel en kwantitatief in vivo secretiesysteem voor het monitoren van de T3SS-functie in EPEC, dat in detail is beschreven in het tweede hoofdstuk. De activiteiten van mijn PhD-project in het lab werden ook uitgebreid tot het upgraden van een online database voor subcellulaire locatie van E. coli K12 proteoom samen met de T3SS van EPEC en verschillende homologen (4e hoofdstuk).

             Een robuuste, snelle en kwantitatieve test is essentieel voor het bestuderen van de functie van T3SS-componenten en de regulatie van secretie. Hiervoor hebben we een in vivo secretie assay ontwikkeld (Hoofdstuk 2) door gebruik te maken van een T3SS-substraat (SctA) en reporter (PhoA) fusie-eiwit (SctA-PhoA). Dit hielp ons om de in vivo translocatorsecretie door het injectisome van EPEC in gebruikt groeimedium van bacterieculturen te volgen en te kwantificeren. Deze vereenvoudigde test is in staat om de extracellulaire SctA-PhoA-secretie te meten in het verbruikte groeimedium van een bacteriecultuur, in afwezigheid van eukaryote cellen. We hebben ook het nut van dit systeem geverifieerd om te screenen op T3SS-mutanten.

             In de T3SS van EPEC wordt de regeling van de tweede schakelaar (d.w.z. de verschuiving van secretie van middelste naar late substraten) niet volledig begrepen. Hier hebben we laten zien dat Ca2+ interageert met het C-domein van de exportpoort, SctV, en dat het werkt als een conformationele schakelaar. SctW plus hoge Ca2+-concentraties bevorderen "midden/translocator" en onderdrukken "late/effector" clientsecretie. Lage Ca2+-concentraties of verlies van SctW keren dit om. SctV is de receptor voor het SctW/CesL/SepD heterotrimeer. We konden voor het eerst het bewijs van interactie Ca2+ met SctV-C detecteren en daarmee het waarschijnlijke mechanisme verklaren voor de omschakeling van secretie van midden naar laat substraat in EPEC. 

             De STEPdb is een online database die wordt gehost door het Laboratorium voor Moleculaire Bacteriologie, Rega Institute. Het bevat een uitgebreide annotatie en handmatige curatie voor alle 4.313 eiwititems van stam E. coli K12. Meer dan 70 kenmerken zoals structurele vouwen, voorspelde secundaire structuren, dynamiek, vroege vouwen, aggregatiegevoelige regio's, topologische, functionele informatie en cellulaire concentraties werden geëvalueerd. De inzendingen zijn gekoppeld aan een downloadbaar PDB-structuurbestand of voorspelde structuur die beschikbaar is in de AlphaFold-database. Daarnaast hebben we vergelijkbare informatie uitgebreid voor meer dan 50 T3SS-eiwitten van EPEC en homologen van andere gramnegatieve bacteriële pathogenen. De STEPdb 2.0 is online beschikbaar op stepdb.eu.