De regulatie van de fotosynthese door ethyleen in tomatenplanten

Ethyleen is een vluchtig plantenhormoon dat een regulerende rol speelt in veel aspecten van de groei en ontwikkeling van planten, inclusief de regulatie van de fotosynthese. Het wordt ook beschouwd als een 'verouderings'-hormoon, omdat het nodig is voor processen zoals het rijpen van climacterisch fruit, veroudering van bladeren en bloemen en abscissie. Bovendien is ethyleen ook betrokken bij de regulatie van plantreacties tegen verschillende biotische en abiotische stress.

Het is vastgesteld dat een verhoogde ethyleenproductie (bijvoorbeeld door stress) en signalering kan leiden tot een verminderde groei en uiteindelijk een verminderde gewasopbrengst. Gedeeltelijk is dit te wijten aan de downregulatie van de fotosynthese door een directe en/of indirecte reactie van ethyleen. Er is nog steeds geen definitief werkingsmechanisme voorgesteld voor het regulerende mechanisme waarmee ethyleen controle uitoefent over de fotosynthese. Bovendien is het meeste moleculaire werk met betrekking tot het effect van ethyleen op de fotosynthese gedaan in de modelplant Arabidopsis thaliana, en gebruik makend van ethyleenperceptie en -signaleringsmutanten die het temporele en dynamische effect van ethyleen niet kunnen onthullen.

In deze studie hebben we een karakterisering uitgevoerd van de temporele effecten van ethyleen op de fotosynthesedynamiek van jonge tomatenplanten. Hiervoor, hebben we real-time fotosynthesemetingen uitgevoerd onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden, waarbij ook rekening is gehouden met het temporele aspect van het ethyleeneffect. We hebben ons gericht op het 4e blad van tomatenplanten, dat een jong, fotosynthetisch actief source blad vertegenwoordigt.

We ontwikkelden een geautomatiseerd ethyleen begassingssysteem om de real-time reacties van planten tijdens de ethyleenbehandeling te volgen en gebruikten een combinatie van fysiologische, biochemische en moleculaire (RNA- en ChIP-seq) experimenten om de temporele dynamiek van het ethyleeneffect op de fotosynthese van planten te ontrafelen. Daarnaast hebben we de impact beoordeeld van een ethyleenvoorbehandeling (ook wel priming genoemd) om de tolerantie van tomatenplanten voor externe omgevingsstressoren, zoals zout-, droogte- en lage zuurstofstress, te evalueren. Het is gekend dat deze stressors de fotosynthese beïnvloeden en leiden tot een vermindering van de opbrengst.

Onze studie toont aan dat ethyleen een dosisafhankelijk effect heeft op de fotosynthese en bevestigt dat een langdurige blootstelling aan verzadigende ethyleenconcentraties de plantengroei onderdrukt door de fotosynthese te remmen. De vermindering van de fotosynthese veroorzaakt door ethyleen leidt uiteindelijk tot de uitputting van de hexose-voorraad, wat essentieel is voor het voeden van metabole processen die verantwoordelijk zijn voor energieproductie. Bovendien onthulden we de integratie van fysiologische en biochemische gegevens met tijdsafhankelijke transcriptoom analyses dat ethyleen de fotosynthese via temporeel verschillende processen remt, wat een complex samenspel is van vroege en directe ethyleenreacties en indirecte secundaire reacties, die we in drie verschillende fasen kunnen groeperen.

In de eerste fase (0 – 8 uur) lokt ethyleen een onmiddellijke reactie uit, die leidt tot respectievelijk epinastie en de sluiting van de huidmondjes, waardoor de lichtperceptie en de gasuitwisseling worden beperkt. De sluiting van de huidmondjes vond snel plaats, wat suggereert dat het een vroege fysiologische reacties op ethyleen is, en dat ethyleen rechtstreeks kan inwerken op mechanismen die de sluiting van de huidmondjes regelen, waarbij waarschijnlijk een reeks secundaire boodschappers betrokken zijn, zoals reactieve zuurstofspecies (ROS), stikstofmonoxide (NO), en kinases. Naast een vermindering van de gasuitwisseling, wekt ethyleen ook epinastie op, wat een van de meest gekende fysiologische reacties is. Epinasty veroorzaakt een verminderde lichtperceptie, wat kan leiden tot een lagere expressie van genen die betrokken zijn bij de fotosynthetische lichtreacties, waaronder antenne-eiwitcomplexen, PSI, PSII, cytochroom b6/f, elektronentransporteiwitten en F-type ATPase, wat ook bevestigd werd door onze RNA-seq resultaten. Een combinatie van het directe ethyleeneffect en deze secundaire, indirecte reacties (verminderde CO2- en lichtopname), en een algehele remming van de lichtreacties (en chloropastische ATP/NADPH-productie) en de carboxylatiereacties, leidt finaal tot een lager gehalte aan suikers (voornamelijk glucose en fructose).

In de tweede fase (8 – 32 uur) schakelde de behandelde tomatenplanten over van groei- naar een overlevingsmodus als reactie op  het suikertekort en een door ethyleen veroorzaakte energiecrisis. Onze resultaten laten zien dat ethyleen een gecoördineerde opregulatie van verschillende TCA cyclusgenen veroorzaakt. Wij zijn van mening dat ethyleen, ondanks de beperkte beschikbaarheid van suikers, de opwaartse regulatie van de TCA-cyclus kan stimuleren, wat cruciaal kan zijn bij het ondersteunen van de productie van substraten die nodig zijn om de energieproductie te stimuleren tijdens periodes van lage koolstofbeschikbaarheid. Onze resultaten laten verder zien dat genen die betrokken zijn bij lipolyse en vetzuurafbraak, evenals eiwitafbraak, worden opgereguleerd door ethyleen, waardoor planten alternatieve ademhalingssubstraten kunnen gebruiken voor hun energieproductie. Verrassend genoeg onthullen onze resultaten een hoger sucrose gehalte, vooral na 8 en 32 uur van de ethyleenbehandeling. Dit zou kunnen suggereren dat extra sucrose wordt aangemaakt (uit o.a. zetmeelafbraak of een verminderd suikergebruik voor de energievoorziening, of dat sucrose wordt geïmporteerd in het 4e blad wanneer de carboxylatieniveaus dalen.

De derde fase, (56+ uur), wordt ingezet naarmate het blad ouder wordt, waarbij deze voortijdige veroudering wordt veroorzaakt door ethyleen in combinatie met de langdurige energiecrisis. We willen benadrukken dat andere factoren, zoals omstandigheden met weinig licht en een koolstofcrisis, samen met ethyleen een cumulatief effect hebben op het op gang brengen en versnellen van deze verouderingsverschijnselen, wat tevens ook gecontroleerd wordt door leeftijdsgerelateerde factoren. Dit leidt finaal tot de inductie van genen die geassocieerd zijn met senescentie (SAG-genen), die de afbraak van zetmeel en de afbraak van chlorofyl bevorderen.

Onze transcriptoom-gegevens onthulden meer dan 3000 differentieel tot expressie gebrachte genen tijdens de vroege ethyleenbehandeling. Maar om te onthullen welke genen er direct door ethyleen worden gereguleerd, hebben we een ChIP-seq-experiment uitgevoerd met antilichamen tegen een van de vier ethyleen-specifieke master-transcriptiefactoren - EIL1 (Ethylene Insensitive Like 1). Onze bevindingen tonen aan dat EIL1 direct kan binden aan de promotor van slechts een relatief klein aantal genen (10). Dit impliceert dat de meerderheid van de differentieel tot expressie gebrachte genen die worden gereguleerd door ethyleen, het gevolg kunnen zijn van secundaire transcriptionele golven, of worden gecontroleerd door andere EIL-transcriptiefactoren. Bovendien zijn twee van deze door ethyleen geactiveerde EIL1-gecontroleerde genen negatieve regulatoren van de ethyleensignaleringsroute (ETR3 en EBF1) zelf, wat aangeeft dat de ethyleenbehandeling een negatief feedbackmechanisme op zijn signaalroute oproept om de gevoeligheid ervan te verlagen. Bovendien onthulde het ChIP-seq-experiment ook vermeende kandidaat-regulerende transcriptiefactoren (bijv. BHLH87-achtig, TBG5, RAX3-achtig) die ethyleen gereguleerd zijn en mogelijks secundaire transcriptionele golven kunnen activeren om de genexpressie gerelateerd aan fotosynthese te beïnvloeden.

Om de weefselspecifieke werking van ethyleen te evalueren, hebben we ook een EBS:GUS-reporter (EBS - EIN3-bindingsplaats) gegenereerd in de achtergrond van Ailsa Craig. Verrassenderwijs was er geen sterk verschil in het GUS-signaal tussen onbehandelde controleplanten en met ethyleen behandelde (1 ppm gedurende 4 uur) planten na kleuring (gedurende 6-7 uur). We zagen een lichte toename van de algehele GUS-kleuring in de behandelde planten, vooral in sommige bladpunten en ouder wordende bladeren/cotyledonen. Dit, samen met de ChIP-seq-resultaten, suggereert aan dat de meeste reacties op ethyleen het resultaat zijn van secundaire effecten, in plaats van directe ethyleeneffecten. Maar dit doet ons ook afvragen of er enkele centrale hubs (transcriptiefactoren) zijn die door ethyleen worden gereguleerd en stroomafwaartse bijkomstige transcriptionele reacties versterken.

Tijdens de normale ontwikkeling produceren planten slechts een laag basaal niveau van ethyleen, maar de ethyleensynthese wordt sterk geactiveerd tijdens biotische en abiotische stressomstandigheden. Ethyleen speelt dus een cruciale rol in het activeren van stress-gerelateerde overlevingsmechanismen en daarom wilden we het effect bestuderen van een ethyleenvoorbehandeling (priming) op de plantprestaties tijdens verzilting, droogte en wateroverlast. We beoordeelden fysiologische reacties (bijv. epinastische buiging, transpiratie, CO2-opnamesnelheden) en het effect op de biomassa ontwikkeling van de plant (vers en droog gewicht). Onze resultaten tonen aan dat deze stressors allemaal een negatieve invloed hebben op alle gemeten parameters, en dus leiden tot de remming van de fotosynthese en een lagere biomassaproductie en gewasopbrengst. Een korte voorbehandeling met ethyleen (1 ppm gedurende 4 uur) verlichtte deze negatieve effecten niet tijdens lage zuurstof stress, terwijl de ethyleen voorbehandeling de planten wel gevoeliger maakte voor zoutstress (door de sluiting van de huidmondjes te verminderen en waterverlies te vergroten). Bij blootstelling aan droogte stress, resulteerde een voorbehandeling met ethyleen in een iets lagere transpiratiesnelheid, waardoor planten beter water kunnen vasthouden in omstandigheden met beperkte waterbeschikbaarheid.

Hoewel er reeds onderzoek is gedaan naar de effecten van ethyleen op de fotosynthese, is er nog steeds een gebrek aan kennis over wat de directe effecten van ethyleen zijn en welke moleculaire spelers er stroomafwaarts van de EIL's bij betrokken zijn. Onze ChIP-seq en tijdsverloop RNA-seq-resultaten lichten het tipje van de ijsberg, maar toekomstige mechanistische vervolgstudies zijn nodig om te begrijpen hoe ethyleen een cascade van reacties activeert die leiden tot de remming van de fotosynthese en uiteindelijk veroudering. Bovendien geven onze bevindingen aan dat het voorbehandelen van tomatenplanten met ethyleen mogelijk hun reactie op de opkomende abiotische stress kan reguleren. Het moet echter nog worden bepaald of deze modulatie een netto positief of negatief effect heeft of helemaal geen effect heeft op de fotosynthese en het algehele metabolisme van de plant. Verder onderzoek is nodig om de voor- en nadelen van een ethyleenvoorbehandeling in deze context volledig op te helderen.