Biologische karakterisatie van nieuwe CXCR4 en CXCR7/ACKR3 receptorinhibitoren

Chemokinereceptoren zijn gevalideerde therapeutische doelwitten die op grote schaal onderzocht werden op hun betrokkenheid bij de groei van kanker en metastasering daarvan, inflammatoire aandoeningen en infectieziekten. Chemokinereceptor CXCR4 was een van de eerst ontdekte coreceptoren die het binnendringen van HIV in menselijke cellen mogelijk maakt, en is nog steeds van groot belang in dit opzicht. Grote inspanningen werden geleverd in het ontwerp, de synthese en de in vitro karakterisering van CXCR4-remmers die in staat zijn om te interfereren met de aanhechting van HIV aan het membraan van de gastheercel. Het belangrijkste ligand voor CXCR4 is de chemokine CXCL12. Behalve CXCR4 bleek CXCL12 ook te binden aan CXCR7/ACKR3, die fungeert als een alternatieve receptor met een zeer hoge affiniteit voor CXCL12. Zowel CXCR4 als CXCR7 zijn gelijktijdig betrokken bij CXCL12-gemedieerde cellulaire responsen, waarbij CXCR7 fungeert als een scavenging-receptor voor CXCL12 om de lokale en systemische biologische beschikbaarheid van CXCL12 en dus CXCR4-activiteit te reguleren.

In dit Ph.D. werk, hebben we eerst een vergelijkende studie uitgevoerd van in vitro CXCR4-specifieke celgebaseerde testen, waaronder een CXCL12 competitie bindingstest, CXCL12-geïnduceerde calciumsignalering en verschillende functionele testen voor het bestuderen van door CXCL12-geïnduceerde receptorinternalisatie, celmigratie, en HIV-1 replicatie-experimenten met CXCR4-gebruikende virusstammen. CXCR4-gerichte liganden (kleine moleculen en peptiden) werden in dit onderzoek geïmplementeerd om het screeningpotentieel van deze CXCR4-gerelateerde testen te valideren. Uit onze vergelijkende analyse concludeerden we dat de CXCL12 competitie bindingstest een hoge waarde heeft als eerste screeningplatform om krachtige CXCR4-remmers te ontdekken, terwijl de testen gebaseerd op CXCR4 effectorfuncties van belang zijn voor de identificatie van vooringenomen van de ligand voor een bepaald type van receptorsignalering.

In tegenstelling tot CXCR4 kan de chemokinereceptor CXCR7 niet signaleren via de klassieke G-proteïne-gemedieerde route. Om selectieve CXCR7-activerende moleculen te bestuderen, ontwikkelden we een G-proteïne-onafhankelijke signaaltest om de ligand-geïnduceerde rekrutering van een cytoplasmatisch adaptoreiwit, ß-arrestine 2 (ARRB2), naar het intracellulaire deel van het CXCR7-membraaneiwit te detecteren. We hebben met succes een ARRB2-rekruteringstest ontwikkeld op basis van de NanoBiT-complementatietechnologie (Promega), die gebaseerd is op de complementatie van twee delen van een gesplitst NanoLuc-luminescent enzym gefuseerd met CXCR7 en ARRB2. Rekrutering van ARRB2 naar CXCR7 resulteerde in de vorming van een functioneel NanoLuc-enzym dat een luminescent signaal genereerde.

Vervolgens werden CXCR4-gerichte kleine moleculen, afgeleid van de bicyclamstructuur van AMD3100, gesynthetiseerd in samenwerking met de groep van prof. Steve J. Archibald van de Universiteit van Hull (Verenigd Koninkrijk). Structurele veranderingen in de originele AMD3100-bicyclamstructuur omvatten aanpassingen aan de ringgrootte van de cyclams, metaalcomplexatie en introductie van zij-/kruisbruggen binnen elk van de cyclameenheden. Deze nieuw gesynthetiseerde bicyclams vertoonden een hoge affiniteit interactie met CXCR4 en een verbeterd interactieprofiel wanneer we ze evalueerden in de bovengenoemde CXCR4-specifieke binding- en activiteitstesten. In parallel werden macrocyclische kleine moleculen die structureel afkomstig waren van M40403, een gevalideerde superoxide dismutase (SOD) nabootser, gesynthetiseerd in samenwerking met de groep van Prof. Thomas W. Bell van de Universiteit van Nevada (Verenigde Staten). Evaluatie van de M40403-derivaten (SH-moleculen) onthulde een interessante dubbele activiteit voor een selectie van de SH-moleculen met zowel CXCR4-remmende als SOD-nabootsende activiteit met een hypothetisch potentieel voor de behandeling van reumatoïde artritis.

Ten slotte werden twee studies uitgevoerd in het kader van het ontrafelen van bindingswijzen van CXCR4- en CXCR7-liganden aan hun verwante receptoren voor de toekomstige ontwikkeling van nieuwe inhibitoren voor chemokinereceptoren met hetzij diagnostisch hetzij therapeutisch potentieel bij pathologische aandoeningen waarbij CXCR4 en/of CXCR7 betrokken zijn. In één studie, in samenwerking met de groep van Dr. Andy Chevigné (LIH, Luxemburg), werden peptiden afgeleid van de N-terminale regio van de chemokinen CXCL12, CXCL11 en vCCL2 gebruikt om bindings- en activatiemodi van CXCR4 en CXCR7, evenals van de klassieke CXCL11 receptor CXCR3, te vergelijken. Onze analyse toonde aan dat, in tegenstelling tot binding en activering van CXCR4 en CXCR3, noch de meest proximale resten noch de N-lus essentieel zijn voor binding en activering van CXCR7. Deze resultaten impliceren een duidelijk ligand-interactiemechanisme voor CXCR7 en tonen dat deze receptor een sterke neiging heeft tot activatie ervan. In een tweede onderzoek onderzochten we de rol van CXCR7 als coreceptor bij het binnentreden van HIV in de gastheercel. Om de CXCR7-coreceptoractiviteit te analyseren, introduceerden we verschillende klassen van CXCR7-gerichte liganden (d.w.z. kleine moleculen, monoklonale antilichamen en chemokinen) in onze cel-gebaseerde HIV-studie. Over het algemeen konden de CXCR7-liganden allemaal interfereren met de opname van CXCR7-gebruikende virusstammen, wat eerdere studies over de betrokkenheid van CXCR7 bij HIV-replicatie bevestigde. Desalniettemin werd differentiële activiteit waargenomen (1) tussen verschillende ligand-klassen, die meestal konden worden verklaard door variatie in moleculaire grootte en dus ook in de hoeveelheid interactieresiduen die deelnemen aan receptorbezetting, en (2) binnen elke ligandklasse, hoogstwaarschijnlijk te wijten aan differentiële receptoroppervlakte-binding van aminozuurresiduen, die wel of niet samenvallen met de interactieresiduen van het gp120 envelopeiwit van HIV.