HIV nucleaire import en chromatine lezing als nieuwe doelwitten voor geneesmiddelenontwikkeling

De replicatiecyclus van HIV is een ingewikkelde wisselwerking tussen virale en cellulaire eiwitten. Tot nog toe focust antiretrovirale therapie zich vooral op virale eiwitten, hoewel de interactie tussen virale en cellulaire eiwitten een interessant nieuw doelwit voor geneesmiddelen kan zijn. Deze strategie is vooral interessant omdat cellulaire eiwitten minder gevoelig zijn aan mutaties die het virus de kans geven om resistentie tegen geneesmiddelen te ontwikkelen. Onze onderzoeksgroep is geïnteresseerd in cellulaire cofactoren van het virale enzym integrase. In 2003 werd LEDGF/p75 ontdekt door Cherepanov et al. als een interactiepartner van integrase. In 2008 werd transportine-SR2 door Christ et al. gevonden als een cofactor van integrase. Transportine-SR2 speelt een belangrijke rol in de nucleaire import van het virus en LEDGF/p75 leidt het virale DNA naar actief overgeschreven chromatine waar het kan integreren. Beide eiwitten vormen interessante nieuwe doelwitten voor de behandeling van HIV. Naast zijn rol in HIV replicatie, speelt LEDGF/p75 een rol in “mixed lineage” leukemie. Dit type van kanker wordt veroorzaakt door translocaties in het MLL1 gen en treft vooral kinderen. De chromatine lezende functie van LEDGF/p75 gebruiken als nieuw doelwit kan daarom interessant zijn voor de behandeling van zowel HIV als kanker.

In het eerste hoofdstuk van deze doctoraatsthesis focus ik op de TRN-IN interactie en probeer om meer inzicht te krijgen in de manier waarop beide eiwitten binden. Omdat nucleaire import algemeen aanzien wordt als de limiterende factor in de virale replicatiecyclus zou het een interessant nieuw doelwit voor antiretrovirale therapie kunnen zijn. Eerdere studies hebben reeds aangetoond dat het vooral het katalytische domein en het C-terminale domein van integrase zijn die interageren met transportine-SR2. Het doel van dit werk is om meer inzicht te krijgen in dit eiwitcomplex en om de interessante regio’s in TRN-SR2 die verantwoordelijk zijn voor integrase binding te ontdekken. In samenwerking met het bio-kristallografie labo heb ik aangetoond dat een TRN-SR2 molecule kan binden aan een dimeer van het katalytische domein gefuseerd met het C-terminale domein. In een volgende stap heb ik transportine-SR2 verdeeld in kleine peptiden, waarvan elk overeen kwam met een zogenaamde “HEAT” herhaling. Ik heb de AlphaScreen technologie gebruikt om te achterhalen of deze peptiden nog steeds konden binden aan integrase. Deze studie bracht aan het licht dat het vooral het N-terminale gedeelte van transportine-SR2 is dat bindt aan integrase, in hoofdzaak via de peptiden 4, 10 en 11. Gebaseerd op deze resultaten, in combinatie met kleine-hoek X-stralen diffractie voor het complex met het integrase fragment en transportine-SR2, stel ik een model voor waarin de nucleaire import van het pre-integratie complex in parallel kan gebeuren met het transport van normale, endogene cargo-eiwitten.

Het tweede deel van deze thesis heeft als doel om nieuwe antivirale geneesmiddelen te ontdekken die niet gevoelig zijn aan kruisresistentie met reeds bestaande geneesmiddelen. Dit hoofdstuk beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een AlphaScreen-gebaseerde pijplijn om op relatief grote schaal inhibitoren van de TRN-IN interactie te vinden. In totaal werden 25608 kleine moleculen getest. Nadat vals positieve en aspecifieke inhibitoren verwijderd werden uit de lijst met kandidaat inhibitoren, bleven er twee reeksen met actieve moleculen over. Hoewel de mate van inhibitie van de moleculen in testen met enkelvoudige en meervoudige infectie-ronden eerder beperkt was, waren ze toch in staat om de nucleaire import van fluorescent gemerkte HIV partikels significant te inhiberen. Deze studie toonde aan dat het mogelijk is om de AlphaScreen technologie te gebruiken om op grote schaal een nieuwe klasse van inhibitoren te testen. Deze resultaten bevestigen bovendien nogmaals het belang van de rol van de TRN-IN interactie in nucleaire import. Onze moleculen zijn de eerste kleine moleculen die deze stap in de virale replicatiecyclus kunnen inhiberen en zijn belangrijk voor de verdere ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen tegen de nucleaire import van HIV.

Het laatste deel van dit werk focust op de eiwit-chromatine interactie tussen LEDGF/p75 en het getrimethyleerde lysine 36 van histon 3 (H3K36me3). Het PWWP domein van LEDGF/p75 speelt een belangrijke rol in het richten van het HIV pre-integratie complex naar het chromatine van de gastheer cel. Ook in het geval van “mixed lineage” leukemie is LEDGF/p75 verantwoordelijk voor het leiden van het kwaadaardige MLL/MENIN complex naar actief overgeschreven genen. De interactie tussen LEDGF/p75 en H3K36me3 als doelwit gebruiken zou dus voordelige therapeutische effecten kunnen hebben in de behandeling van zowel HIV als “mixed lineage” leukemie. Dit deel van de thesis beschrijft de ontwikkeling en implementatie van een fragment-gebaseerde geneesmiddelenontwikkeling strategie. Computer gesimuleerde modellen werden gebruikt voor een virtuele screen van meer dan 4 miljoen moleculen om te voorspellen of ze aan het PWWP domein zouden binden. De 525 beste moleculen werden vervolgens geselecteerd en een AlphaScreen gebaseerde test werd gebruikt om de beste moleculen uit deze kleine bibliotheek op te pikken. Alle moleculen werden eveneens getest in een nano-DSF experiment waarin de intrinsieke tryptofaan fluorescentie van het PWWP domein wordt bestudeerd tijdens de thermische denaturatie van het proteïne in aan- en afwezigheid van moleculen. Initiële resultaten toonden aan dat, hoewel het effect slechts beperkt was, sommige van onze moleculen inderdaad de interactie tussen LEDGF/p75 en H3K36me3 kunnen inhiberen. Daarom werd er in parallel gewerkt aan een kristal structuur van het PWWP domein. Deze structurele informatie is nuttig voor de verdere chemische optimalisatie van onze moleculen.

Kort samengevat beoogt dit werk om nieuwe doelwitten voor geneesmiddelenontwikkeling voor de behandeling van HIV en “mixed lineage” leukemie te ontdekken en valideren. Proteïne-proteïne en proteïne-chromatine interacties kunnen interessante nieuwe doelwitten zijn omdat het risico op kruisresistentie met reeds beschikbare geneesmiddelen eerder klein is. De grootste uitdaging in het focussen op deze interacties is evenwel het ontwikkelen van specifieke geneesmiddelen die de interferentie met de werking van andere, gelijkaardige proteïnen en bindingspartners tot een minimum beperken.