Onderzoek naar de rol van GARP door gebruik van cel-specifieke knock-out muizen

Glycoprotein A repetition predominant protein (GARP) is een transmembraan eiwit dat latent transforming growth factor-b (TGF-b) op het oppervlak van het membraan van regulatorische T cellen (Treg), bloedplaatjes en endotheelcellen brengt. Latent TGF-b bestaat uit matuur TGF-b en het latent geassocieerde peptide (LAP), dat het matuur TGF-b weerhoudt om te binden aan de TGF-b receptor. Latent TGF-b moet eerst geactiveerd worden om vervolgens zijn functie te kunnen uitoefenen. Momenteel is het exacte activatie mechanisme nog niet volledig gekend, maar er is reeds evidentie dat het integrine aVb8 betrokken is.

In vitro en in vivo studies toonden reeds aan dat GARP op Treg bijdraagt tot de immunosuppressieve functie van deze cellen. Neutraliserende monoklonale antilichamen gericht tegen het GARP/latent TGF-b complex en experimenten waarin GARP expressie onderdrukt werd, toonden in vitro aan dat matuur TGF-b niet gesecreteerd kon worden en in vivo dat de immunosuppressieve activiteit van humane Treg verminderd was in een graft versus host ziektemodel. Dit toont aan dat inhibitie van GARP zorgt voor een vermindering van de Treg functie en dus indirect geactiveerde effector cellen stimuleert. Naast Treg, brengen ook bloedplaatjes GARP tot expressie. Genetische deletie van garp in bloedplaatjes van muizen zorgt voor een vertraagde groei van MC38 colon kanker tumoren. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan een verminderde TGF-b activiteit ter hoogte van de tumor. Deze publicatie gaf voor het eerst evidentie dat naast GARP op Treg, ook GARP op plaatjes betrokken is in het onderdrukken van het immuunsysteem.

Naast de rol in het onderdrukken van het immuunsysteem, was er ook een rol voor GARP binnen trombose en hemostase voorspeld. Expressie profielen van o.a. voorlopercellen van bloedplaatjes en rode bloedcellen werden vergeleken aan de hand van een microarray. Hier zag men dat GARP expressie specifiek opgereguleerd was in voorlopercellen van de bloedplaatjes en ook in endotheelcellen, maar niet in de rode bloedcellen. Daarnaast heeft GARP specifieke structurele eigenschappen die interessant zouden kunnen zijn in trombose en hemostase. Daarom werd een laser geïnduceerd trombose model uitgevoerd in zebravissen waarin de expressie van GARP verhinderd werd. De studie wees uit dat GARP een positieve regulator is van trombus vorming aangezien er een latere en een kleinere trombus werd gevormd in deze zebravissen. Deze experimenten gaven voor het eerst evidentie aan dat GARP een rol heeft binnen trombose en hemostase.

In deze thesis hebben we uitgaande van deze bevindingen nagegaan of GARP op muis Treg en bloedplaatjes bijdraagt tot het onderdrukken van het immuunsysteem in een kankersetting. Daarnaast, bestudeerden we de rol van GARP binnen trombose en hemostase in mens en muis.

Hiervoor werden muizen met een specifieke genetische deletie van garp in Treg, bloedplaatjes of endotheelcellen gemaakt aan de hand van het Cre-loxP recombinatie systeem (DOEL 1). Om de rol van GARP in het onderdrukken van het immuunsysteem te onderzoeken werden Treg en bloedplaatjes conditionele garp knockout muizen enerzijds orthotoop geïnjecteerd met GL261 hersentumorcellen of anderzijds subcutaan met MC38 colonkankertumorcellen. In een derde tumormodel, uitgevoerd in de Treg conditionele garp knockout muizen, werden fibrosarcoma tumoren geïnduceerd door de injectie van methylcholantreen. Daarnaast werd ook gekeken of systemische inhibitie van GARP door profylactische injectie van neutraliserende antilichamen gericht tegen GARP zou leiden tot een tragere tumor groei. Als laatste werd ook de combinatie van anti-PD-1 met inhibitie van GARP door de antilichamen of door gebruik te maken van de Treg conditionele garp knockout muizen, getest (DOEL 2).

De functie van GARP deficiënte bloedplaatjes werd gemeten aan de hand van flow cytometrie, spreidingsanalyse en aggregatie experimenten na stimulatie met PAR-4 activerend peptide en het collageen gerelateerde peptide. Daarnaast werden deze bloedplaatjes getest in clot retractie en aggregaties onder bloedstroom condities. In vivo werden bloedingstijden en de occlusietijden in mesentere en carotis bloedvaten na inductie van een trombose via FeCl3 gemeten. Als laatste werden in vitro aggregaties en agglutinatie studies uitgevoerd met humane plaatjes waaraan konijn polyklonaal anti-GARP antiserum of GARP neutraliserende monoklonale antilichamen werden toegevoegd (DOEL 3).

Inhibitie van GARP door herhaalde injecties met neutraliserende monoklonale antilichamen of door genetische deletie van garp in muis Treg of bloedplaatjes leidde niet tot een langere overlevingstijd van muizen die getransplanteerd waren met de GL261 hersentumorcellen. Daarnaast werd ook geen vertraagde tumor groei gemeten in muizen met subcutaan geïnjecteerde MC38 tumor cellen. Echter, minder muizen met een deletie van garp in Treg ontwikkelden fibrosarcoma tumoren in vergelijking met controle muizen. Preliminaire experimenten toonden verder aan dat profylactische inhibitie van GARP gecombineerd met blokkade van de immuun checkpoint inhibitor PD-1 door monoklonale antilichamen, resulteerde in vertraagde tumor groei. Deze resultaten tonen aan dat GARP immunosuppressieve eigenschappen heeft die mogelijke toepassingen kennen in oncologie. Het synergistisch effect was hoogstwaarschijnlijk te wijten aan GARP dat tot expressie komt op Treg aangezien we vonden dat anti-PD-1 behandeling in Treg conditionele garp knockout muizen tot een gelijkaardige tumor afstoting leidde (DOEL 2).

Muis bloedplaatjes zonder GARP vertoonden normale agonist geïnduceerde activatie, spreiding op fibrinogeen en aggregaties. Analoog aan de muisexperimenten zagen we geen effect van neutraliserende anti-GARP antilichamen op aggregaties van humane bloedplaatjes geïnduceerd door ADP of collageen, terwijl de antilichamen zelf ook geen plaatjesaggregatie of –agglutinatie veroorzaakten. GARP deficiënte plaatjes beïnvloedden clot retractie niet en hadden geen impact op aggregaatvorming in stromend bloed. In lijn met deze resultaten waren ook de bloedingstijden en de occlusietijden in het carotis en mesenteer trombose model niet veranderd in zowel de plaatjes als de endotheel conditionele garp knockout muizen. Deze resultaten geven sterke evidentie dat plaatjes en endotheel GARP niet betrokken zijn in trombose en hemostase in mens en muis (DOEL 3).

In conclusie kunnen we stellen dat GARP op Treg immunosuppressieve eigenschappen heeft. In een volgende stap kan onderzocht worden of anti-GARP antilichamen therapeutische eigenschappen hebben en dus de immuun respons zouden verbeteren om zo tumor afstoting te bevorderen. Bij deze therapie worden geen neveneffecten verwacht met betrekking tot trombus vorming of het ontstaan van bloedingen aangezien we geen betrokkenheid van GARP hebben kunnen aantonen in deze processen. De resultaten geven dus interessante inzichten binnen oncologie en kunnen eveneens uitgebreid worden tot andere Treg gerelateerde ziektes.