Upstream regulatoren van de plant energie sensor SnRK1

Planten zijn cruciale organismen voor het leven op Aarde. Ze zetten de elektromagnetische energie van zonlicht om naar bruikbare chemische energie via fotosynthese, waarbij ook zuurstof als bijproduct vrijkomt. Daarnaast maken ze hernieuwbare producten zoals voedsel, voeder, vezels en brandstof. In tegenstelling tot de meeste andere organismen, hebben autotrofe planten ook een sessiele levensstijl. Het is dus essentieel om de omgeving continu te monitoren en minimale fluctuaties in licht-, nutriënt- en energievoorziening op te merken. Planten hebben dan ook verschillende signaleringsmechanismen ontwikkeld om deze veranderingen te detecteren en er gepast op te reageren. Een sleutelrol blijkt weggelegd voor het Sucrose non-fermenting 1-related kinase 1 (SnRK1), het plant homoloog van het dierlijk AMP-activated kinase (AMPK) en gist Sucrose non-fermenting 1 (SNF1). Het geconserveerde heterotrimere proteïnekinase-complex gedraagt zich, net zoals zijn dier en gist homologen, als een energie-sensor die geactiveerd wordt wanneer de energiewaarden in de plant dalen. Dit initieert de herprogrammering van het metabolisme, waarbij een energiebesparende overlevingsmodus wordt geïnitieerd door ATP-producerende reacties (catabolisme) te activeren en ATP-consumerende processen (anabolisme) uit te schakelen. Een van de gevolgen van deze centrale rol in het onderhouden van de cellulaire energie-homeostase is dat SnRK1 direct of indirect bijna elk proces in de plant beïnvloedt, van stress-responsen tot cruciale ontwikkelingstransities en groei. Begrijpen hoe SnRK1 exact gereguleerd wordt en hoe SnRK1 zijn doelwitten affecteert is belangrijk, zowel een fundamenteel begrip van hoe planten werken, als voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om stress-tolerantie en oogstopbrengst te verhogen. In dit werk hebben we de regulatie van Arabidopsis SnRK1 in detail onderzocht met behulp van cellulaire analyses (transiënte proteïne-expressie in bladcellen) en mutante en transgene planten. We hebben meer specifiek de moleculaire mechanismen bestudeerd achter de vorming van het SnRK1 complex en de opmerkelijk negatieve regulatie van SnRK1 activiteit door (i) de SnRK1 regulatorische subeenheden, (ii) het enzym catalase en (iii) een nieuwe plant-specifieke proteïnefamilie, de SnRK1-Interacting Negative regulators of SKINs.

We hebben eerst de huidige kennis van de structuur, functie en regulatie van SnRK1 besproken. De sterke conservatie van dit eukaryoot kinase complex laat ons toe om ook de kennis uit gist- en zoogdieronderzoek te gebruiken. We ontwikkelden een 3D moleculair model, gebaseerd op de homologie met AMPK, wat inzicht geeft in de structuur van het plantencomplex en toelaat nieuwe hypothesen over de regulatie ervan te ontwikkelen.

Vervolgens hebben we de regulatiemechanismen van de SnRK1-activiteit zelf bestudeerd. In tegenstelling tot AMPK en SNF1, is het plant kinase niet gereguleerd door de cellulaire nucleotide-lading (AMP/ATP ratio). SnRK1 blijkt daarentegen geïnhibeerd te worden door suikerfosfaten. In overeenstemming daarmee vonden we dat de katalytische SnRK1α1 subeenheid constitutief actief is. Verschillende soorten lage-energie-stress veroorzaken nucleaire translocatie van SnRK1α1, wat voldoende blijkt te zijn om doelwit-genexpressie te induceren. De SnRK1β subeenheden functioneren als negatieve regulatoren, deels door inhibitie van de nucleaire lokalisatie. Transgene planten waarin de SnRK1α1 lokalisatie werd aangepast, tonen sterke verschillen in ontwikkelingsprocessen en metabole stress-responsen. De inhiberende functie van SnRK1β is afhankelijk van zijn N-terminaal domein, dat gereguleerd wordt door myristoylatie en andere post-translationale modificaties.

Daarnaast identificeerden we het H2O2-hydrolyserende enzym catalase (CAT) als een nieuwe negatieve regulator van SnRK1. Hoewel catalasen typisch gelokaliseerd zijn in de peroxisomen, vonden we dat deze ook deels in het cytosol zitten, waar ze interageren met SnRK1α1 en dit onderdrukken door lokale dismutatie van H2O2. Zowel alternatieve splitsing van de CAT peroxisomale targeting-sequenties (PTS) en cytosolische retentie blijken hiervoor belangrijk. H2O2lijkt te functioneren als een SnRK1 potentiator in lage concentraties, mogelijk door directe redox-regulatie van sterk geconserveerde cysteïne-residu’s in de SnRK1α-subeenheid.

Tot slot hebben we aangetoond dat de recent geïdentificeerde rijst SKINs functioneel geconserveerd zijn als SnRK1-repressoren in Arabidopsis. De Arabidopsis SKIN orthologen en nauw verwante OXS3-familie (geïdentificeerd als proteïnen die oxidatieve stress-tolerantie verhogen), co-lokaliseren en interageren met SnRK1α en represseren zoals in rijst de SnRK1 signalering door het stimuleren van de nucleaire export van SnRK1α.

Samenvattend tonen onze resultaten aan dat planten de oude en sterk geconserveerde SnRK1 signaalweg afgestemd hebben op hun sessiele en autotrofe levensstijl door hun geprefereerde negatieve regulatie, wat zorgt voor een snelle en efficiënte reactie op snel veranderende omgevingsfactoren. In dit werk hebben we verschillende nieuwe negatieve regulatoren geïdentificeerd en maken we suggesties voor toekomstig onderzoek om de moleculaire mechanismen achter deze regulatie verder te exploreren.