Modellering van amyotrofische laterale sclerose: menselijke iPSC-afgeleide astrocyten en neuromusculaire verbindingen in microfluïdische apparaten

Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een neurodegeneratieve ziekte die zowel de bovenste als de onderste motorneuronen in de hersenen en het ruggenmerg aantast, wat resulteert in ernstige neuronale dood en spierverlies. In 10% van de gevallen wordt ALS veroorzaakt door verschillende erfelijke mutaties, terwijl 90% van de gevallen een sporadische etiologie heeft. Op cellulair niveau presenteert ALS een veelzijdig beeld met cytoplasmatische eiwitaggregaties, axonale transportdeficiënties, neuromusculaire junctie (NMJ) ontmanteling en gliale activering. Vanwege deze complexe pathologie, de genetische variatie tussen patiënten en het gebrek aan effectieve translationele experimentele modellen, is het momenteel niet mogelijk om ALS-patiënten met succes van hun symptomen te verlichten of de ziekteprogressie te stoppen. In een poging om de translationele kloof tussen huidige modellen en patiënten te overbruggen, hebben we geprobeerd een volledig menselijk, in vitro, microfluïdisch model te ontwikkelen van een motoreenheid die bestaat uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) afgeleide motorneuronen en menselijke primaire myoprogenitor -afgeleide myotubes bij de vorming van functionele NMJ's. Met behulp van in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaten werden motorneuronen en myotubes samen gekweekt in afzonderlijke, vloeistofgeïsoleerde compartimenten, maar nog steeds axonale verbindingen via microgroeven mogelijk. De interactie tussen motorneuronneurieten en myotubes maakte de spontane vorming van NMJ's mogelijk en met de toevoeging van kleine moleculen agrine en laminine nam het aantal NMJ's toe. Door motorneuron-soma's in één compartiment chemisch te stimuleren, kon een instroom van calcium in calciumgevoelige Fluo-4-gelabelde myotubes worden geregistreerd in het aangrenzende compartiment, wat een verbinding bevestigt via functioneel actieve NMJ's. NMJ's zijn bijzonder kwetsbaar bij ALS en er is aangetoond dat ze vroeg in de ziekteprogressie uiteenvallen. Om dit fenomeen in ons model verder te onderzoeken, werden van FUS-ALS-patiënt iPSC afgeleide motorneuronen samen met myotubes gekweekt. Dit onthulde een door ALS gemedieerde stoornis in de uitgroei, hergroei en NMJ-vorming van motorneuronen, die zou kunnen worden gered door de mutatie te corrigeren door middel van CRISPR/Cas9-gen-editing. Daarnaast hebben we het therapeutische potentieel van histondeacetylase 6 remmer Tubastatine A in ons systeem onderzocht, wat een reddend effect op de uitgroei van neurieten en een verbetering van de NMJ-aantallen liet zien.
Toenemend bewijs van een niet-neuronale celbijdrage aan ALS-pathologie is duidelijk, wat het belang van onderzoek binnen fenotypes van gliacellen in relatie tot neurodegeneratieve ziekten benadrukt. Reactiviteit van astrocyten met een daaropvolgend toxisch effect op motorneuronen is vastgesteld in verschillende ALS-modellen van knaagdieren, post-mortem en celcultuur, maar er is meer onderzoek nodig om de onderliggende mechanismen vast te stellen. Om de astrocytische bijdragen in ALS verder te onderzoeken, hebben we FUS-ALS iPSC-afgeleide astrocyten gegenereerd en deze cellen vergeleken met hun individuele CRISPR/Cas9-gen-bewerkte isogene controle-tegenhangers. We vonden een FUS-ALS-gemedieerde ontregeling van de astrocytenhomeostase die wordt gekenmerkt door calciumhyperactiviteit, mutatie-afhankelijke transcriptionele veranderingen, verhoogde reactiviteit en emissie van pro-inflammatoire cytokines. Vervolgens hebben we onze astrocyten geïntegreerd in ons microfluïdische model van de motorunit en de astrogliale effecten op NMJ's geëvalueerd. Interessant is dat FUS-ALS-astrocyten toxisch leken voor het motorneuronnetwerk, de uitgroei van motorneuronen en neurieten in gevaar brachten, evenals de vorming en functionaliteit van NMJ. Isogene controle-astrocyten waren in staat om al deze toxische stoornissen te verlichten of te redden. Door verder in het mechanisme van toxiciteit te duiken, ontdekten we een opvallende functionele heterogeniteit door een dynamisch samenspel tussen 1) verlies-van-ondersteuningsmechanisme door downregulatie van meerdere genetische routes die betrokken zijn bij het behoud van optimale neuronale homeostase, en 2) winst-van-toxiciteitsmechanisme via verhoogde astrocytenreactiviteit en cytokinesecretie. Ten slotte ontdekten we dat FUS-ALS-astrocyten tevergeefs proberen deze toxiciteit tegen te gaan door opregulatie van de WNT/β-catenine-route in motorneuronen. In lijn met de groeiende interesse in de effecten van niet-neuronale cellen bij ALS, tonen onze gegevens een centrale rol aan van astrocyten in deze neurodegeneratieve aandoening. Over het algemeen presenteren we een nieuw, gestandaardiseerd co-cultuurmodel, dat kan worden gebruikt om cellulaire interacties bij ALS en bij andere neurodegeneratieve aandoeningen te evalueren, en hopelijk de ontdekking van nieuwe therapeutische toegangspunten te helpen.