< Terug naar vorige pagina

Project

Kristalstructuurbepaling van dynamische Fluorescerende eiwitten

Sinds de ontdekking van Groen Fluorescent Poteïne (GFP), een heleboel nieuwe FPs zijn ontdekt of ontwikkeld zoals dat vandaag het complete kleurenspectrum wordt bestreken. Alle Fluorescent Proteins hebben dezelfde architectuur, bestaande uit een 11-gestrande β vat. Een α-helix kruist het centrum van 't vat en draagt de kan chromofoorschade, autocatalitically gevormd uit een semisynthetische Tripeptide in aërobe omstandigheden. FPs spelen een belangrijke rol in de visualisatie van cellulaire gebeurtenissen. Maar voor subcellulaire visualisatie verscheidene super-resolutie technieken werden ontwikkeld die alle vertrouwen op de specifieke dynamische gedrag van Fluorescent Proteins. Dit dynamisch gedrag kan worden onderverdeeld in drie klassen: onomkeerbaar photoactivation, omkeerbare photoswitching en onomkeerbare conversie van foto's. Onomkeerbare photoconvertible en omkeerbare photoswitchable FPs zijn breed inzetbaar en kunnen omzetten van een groen- naar een rode-uitstralende staat of schakelen tussen een on- en off-state, respectievelijk. Tot op heden heeft echter de belangrijkste factoren die de photoconversion evenals photoswitching bleef onvoldoende begrepen. Door kristalstructuur bepaling enerzijds en een functionele karakterisiering anderzijds, een duidelijke structureel inzicht en een gedegen kennis van deze mechanismen kunnen worden verstrekt. Daarom, in samenwerking met de groep van Peter Dedecker, die we momenteel muteren van een aantal fluorescerende eiwitten zoals pcDronpa2, ffDronpa, rsEGFP en rsGreen0.7. Deze mutanten zal vervolgens worden gekristalliseerd met een kristallisatie robot. De diffractie gegevens worden verzameld met een synchrotron bron (Soleil, Parijs; SLS, Villigen; Elettra, Triëst) en de kristalstructuren zal volledig worden gekarakteriseerd. X-ray diffractie, NMR en Computational studies hebben uitgewezen dat photoswitching wordt begeleid door een cis-trans isomerisatie van de kan chromofoorschade, conformational grenzende aminozuren en verschillen in β barrel flexibiliteit. Het mechanisme van deze photoswitching verder bestudeerd worden door gelijktijdige laser bestraling van het eiwit crystal tijdens de röntgenstralingsgegevens collectie. Bovendien zijn beide NMR en Computational studies hebben aangetoond hoe belangrijk de protonation staat de kan chromofoorschade en haar omliggende aminozuren. Er wordt dan ook van uitgegaan dat de staat, de kan chromofoorschade deprotonated is, terwijl in de off-stand, kan chromofoorschade protonated is. Echter, als men gelooft dat de hydrogen bonding netwerk rond de kan chromofoorschade speelt een leidende rol in photoswitching, wij moeten experimentele gegevens waaruit de waterstofatomen in een kristalstructuur. Monokristallijne neutron diffractie op RSFPs zal daarom worden geprobeerd om de zeer belangrijke commentaar experimentele gegevens over de protonation staten en waterstof netwerken, die nodig zijn voor een goed begrip over de photoswitching mechanisme en de afhankelijkheid van pH. Referenties Nguyen Bich, N.; Moeyaert, B.; Van Hecke, K.; Dedecker, P.; Mizuno, H.; Hofkens, J.; Van Meervelt, L. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2012, 68, 1653-1659. Moeyaert, B.; Nguyen Bich, N.; De Zitter, E.; Rocha, S.; Clays, K.; Mizuno, H.; Van Meervelt, L.; Hofkens, J.; Dedecker, P. ACS Nano 2014, 8, 1664-1673. Duwé, S., De Zitter, E., Gielen, V., Moeyaert, B., Vandenberg, W., Grotjohann; T., Clays, K., Jakobs, J, Van Meervelt, L., Peter Dedecker, P., ACS Nano 2015, 9, 9528-9541. Cloin, B.M.C., De Zitter, E., Salas, D., Gielen, V., Folkers, G.E., Mikhaylova, M., Bergeler, M., Krajnik, B., Harvey, J., Hoogenraad, C.C., Van Meervelt, L., Dedecker, P., Kaptein, L.C., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2017, 114, 7013-7018.

Datum:21 mrt 2018 →  21 mrt 2022
Trefwoorden:fluorescent proteins, reversible photoswitching
Disciplines:Biochemie en metabolisme, Systeembiologie, Medische biochemie en metabolisme
Project type:PhD project