Ontwikkeling van een in vivo gehumaniseerd muismodel voor het bestuderen van hepatotrope virale infecties

De farmaceutische industrie heeft dringend nood aan efficiënte en fysiologisch relevante in vitro en in vivo modellen om hepatotrope virussen te bestuderen, potentiële antivirale middelen te screenen en deze en andere medicatie te testen voor levertoxiciteit. De huidige in vitro modellen zijn gebaseerd op het gebruik van primaire humane hepatocyten (PHHs) en hepatomacellijnen, maar zij hebben beiden nadelen. Daarom wordt het gebruik van humaan pluripotente stamcel (hPSC) afgeleide hepatocyten om hepatotrope virussen te bestuderen, nu als een alternatieve bron van hepatocyten voorgesteld. Inderdaad, eerdere studies hebben aangetoond dat hPSC afgeleide hepatocyten een relevant model zijn om hepatotrope virussen, zoals hepatitis C, hepatitis B, hepatitis E en dengue virus, te bestuderen.

In deze thesis, heb ik onderzocht of hPSC afgeleide hepatocyten ook een relevant model kunnen vormen voor het bestuderen van het zika virus (ZIKV). ZIKV werd recent in verband gebracht met het optreden van microcefalie bij pasgeborenen. Maar bij ZIKV-geïnfecteerde muizen en niet-humane primaten werd de aanwezigheid van virale partikels niet enkel gedetecteerd in de hersenen van de gastheer, maar eveneens in andere organen zoals de lever. Meer nog, twee rapporten hebben een associatie beschreven tussen ZIKV-infectie en het voorkomen van een leverletsels, én het is geweten dat ZIKV tot dezelfde familie van virussen behoord als hepatitis C en dengue virus, twee gekende hepatotrope virussen. Daarom heb ik onderzocht of humane hepatocyten vatbaar zijn voor een ZIKV-infectie. Ik heb aangetoond dat de hPSC afgeleide hepatocyten en de hepatomacellijn, Huh7, de volledige levenscyclus van ZIKV ondersteunen, gaande van de intrede van het virus in de cel tot de virale replicatie en de productie van nieuwe infectieuze ZIKV-partikels. Daarnaast zorgde de behandeling van ZIKV-geïnfecteerde hPSC afgeleide hepatocyten en Huh7 cellen met 7-deaza-2’-C-methyladenosine, een gekende remmer van het virale RNA-polymerase, voor een significante en dosis-afhankelijke daling van ZIKV-replicatie, terwijl 2’-C-methylcytidine en 6-fluoro-3-hydroxypyrazine-2-carboxamide enkel ZIKV-replicatie remden in ZIKV-geïnfecteerde Huh7 cellen. Tenslotte, induceerde ZIKV-infectie enkel de aangeboren immuniteit en een NFκβ respons in ZIKV-geïnfecteerde hPSC afgeleide hepatocyten maar niet in Huh7 cellen. Dit kan mogelijk verklaren waarom het cytopatisch effect in ZIKV-geïnfecteerde Huh7 cellen zo groot is. Deze opmerkelijke verschillen in de respons van de aangeboren immuniteit en de sensitiviteit voor antivirale middelen tussen hPSC afgeleide hepatocyten en hepatomacellen onderstreept nog maar eens de noodzaak om ZIKV en de antivirale activiteit van medicatie niet alleen in cellijnmodellen te testen, maar ook in systemen die fysiologisch meer relevant zijn.

Gezien hPSC afgeleide hepatocyten, die gebruikt werden om de vatbaarheid van hepatocyten voor ZIKV-infectie te bewijzen, eerder lijken op foetale hepatocyten dan op adulte primaire hepatocyten, bezitten ze niet de enzymen die nodig zijn om geneesmiddelen te metaboliseren. Het Verfaillie labo, verbonden met het Stamcel Instituut Leuven, heeft recent metabool betere hPSC afgeleide hepatocyten gecreëerd, die 3 transcriptiefactoren HNF1α, PROX1 en FOXA3 (HC3x-hepatocyten genaamd) tot overexpressie brengen door middel van een doxycycline-inductie, en door de cellen te differentiëren in geoptimaliseerde mediumcondities. Ik heb nagegaan of deze HC3x-hepatocyten een geschikt model zijn om het hepatitis B virus (HBV) te bestuderen en nieuwe antivirale middelen tegen HBV te testen, die mogelijks wel een biotransformatie nodig hebben om geactiveerd te worden. De hoofdreden waarom er nog steeds interesse is voor het bestuderen van HBV is dat er wereldwijd nog 260 miljoen mensen chronisch geïnfecteerd zijn met HBV en de medicatie, die aanwezig is op de markt, de patiënten niet kan genezen door de aanhoudende aanwezigheid van het covalent gesloten circulair (ccc)DNA in de celkern van de hepatocyt. Daarom is er een hoge nood aan nieuwe geneesmiddelen, die de HBV-infectie in chronische patiënten volledig kan elimineren. Ik heb hier aangetoond dat de metabool betere HC3x-hepatocyten efficiënt infecteerbaar zijn met HBV, gebruikmakend van een immunofluorescentie kleuring voor het HBV core antigeen en oppervlakte-antigeen (HBsAg). Verder detecteerde ik ook de aanwezigheid van HBsAg en HBV e-antigeen in het supernatant via ELISA, die toenam met het verloop van de tijd, alsook een hoge titer van infectieuze viruspartikels. Deze data geven aan dat functioneel HBV cccDNA gevormd wordt in de HBV-geïnfecteerde HC3x-hepatocyten. Tenslotte, heb ik dit model ook gevalideerd met verschillende gekende antivirale middelen tegen HBV.

De farmaceutische industrie heeft ook een hoge nood aan geschikte in vivo modellen om hepatotrope virussen te evalueren en medicatie te testen voor levertoxiciteit. Bijgevolg heb ik ook geprobeerd om de metabool betere HC3x-hepatocyten, alsook HC6x-hepatocyten (die niet alleen HNF1α, PROX1, FOXA3 maar ook PGC1α, SIRT1 en AMPK tot overexpressie brengen) te transplanteren in urokinase plasminogeen activator – ernstig gecombineerde immunodeficiëntie (uPA-SCID) muizen om zo muizenmodel te genereren met een humane lever bestaande uit hPSC afgeleide hepatocyten. Zes maanden na de transplantatie werden humane cellen gedetecteerd in de levers van muizen getransplanteerd met HC3x-hepatocyten, maar niet in die met HC6x-hepatocyten. Desondanks was de efficiëntie van inplanting heel laag, ook al zijn deze HC3x-hepatocyten meer matuur dan andere hPSC afgeleide hepatocyten. Bijkomende studies om de reden van de lage inplantingsefficiëntie te achterhalen zijn nodig: het ontbreken van een efficiënte inplanting kan veroorzaakt worden door het gebruik van dit specifieke muismodel of door het onvermogen van de cellen om zich initieel te nestelen in de adulte leveromgeving en/of het onvermogen van de kleine hoeveelheid getransplanteerde hepatocyten om vervolgens te expanderen.