Chemo-enzymatische benadering voor in-situ hybridizatieprobes en hun toepassing in 3D super-resolutie microscopie

Microscopie en meer specifiek fluorescentie microscopie is een geliefd hulpmiddel van vele wetenschappers om kleine biologische structuren te bestuderen die niet waargenomen kunnen worden met het blote oog. Toch is fluorescentie microscopie nog gelimiteerd in resolutie en om detectie van biomoleculen die zich op het nanometer niveau bevinden mogelijk te maken, is er nood aan een verbeterde resolutie. Als oplossing hiervoor werd super resolutie microscopie ontwikkeld, waarmee ultra kleine structuren gevisualiseerd kunnen worden op verschillende manieren. In 2015 creëerde het labo van Edward Boyden in MIT expansie microscopie, een nieuwe en eenvoudige techniek om nanoschaal resolutie te bekomen met een standaard diffractie gelimiteerde microscoop. Door biologische stalen te doordrenken met gepaste monomeren kan er een super absorberend polymeer gevormd worden doorheen het staal, dat vervolgens kan geëxpandeerd worden tot een transparante matrix. Om de originele geometrie van het staal te behouden worden de te onderzoeken biomoleculen verankerd in dit polymeer waardoor het niet enkel mogelijk is om het staal in beeld te brengen met een verbeterde resolutie maar ook de ruimtelijke informatie te behouden van de verankerede moleculen in de cellulair context.

In dit onderzoek zullen wij gebruik maken van expansie microscopie om biologische vragen in verschillende wetenschappelijk velden te bestuderen, gaande van membraan studies en epigenetica tot virologie studies. Eerste resultaten tonen de ontwikkeling van tri-functionele labels die simultaan de gewenste biomoleculen kunnen vinden, verankeren en detecteren in de hydrogel. Hierdoor was expansie van membraan structuren mogelijk samen met het gebruik van kleine labels zoals phalloidin, wat eerder niet kon in expansie microscopie. Daarnaast toonde we ook aan dat het gebruik van een andere fluorescente kleurstof een effect had op welk membraan er gekleurd werd in de cellen. Daarna bestudeerde we niet langer verschillende structuren maar keken we meer in detail naar de cel nucleus om het epigenoom te onderzoeken. Het doel hier was om een methode te ontwikkelen die ons informatie kan geven over interacties die plaatsvinden tussen epigenetische lezers en verschillende epigenetische histon modificaties. Dit was mogelijk door zowel immuno-kleuring, expansie microscopie en co-lokalisatie technieken met elkaar te combineren en zo expansie microscopie voor epigenetica of ExEpi te ontwikkelen. Twee verschillende epigenetische lezers, BRD4 en LEDGF, werden in meer detail onderzocht om de methode te valideren en hun favoriete epigenetische modificaties, H3K9/14ac en H3K36me3, werden bevestigd door ExEpi. Wanneer een langzaam stijgende concentratie van een BET-inhibitor JQ1 werd toegevoegd, werd ook een daling in co-lokalisatie tussen BRD4 en H3K9/14ac waargenomen. Omwille hiervan speculeren wij dat deze methode ook kan gebruikt worden in de toekomst om nieuwe epigenetische medicatie te ontdekken en bestuderen. Uiteindelijk werd expansie microscopie gebruikt als een tactiek om twee verschillende retrovirussen te bestuderen namelijk MLV en HIV-1. Er werd gekeken naar de interacties die plaatsvonden tussen MLV en histon acetylatie, door onze eerdere ExEpi methode wat aan te passen om MLV pre-integratie complexen te kunnen lokaliseren in de plaats van epigenetische lezers. Op deze manier werd ook een vergelijkende studie uitgevoerd tussen MLV wild type vectoren en MLV BET onafhankelijke vectoren, dit om het potentiele verschil in hun verdeling in de nucleus te analyseren. Uiteindelijk werd expansie microscopie toegepast in combinatie met singel virus analyses van HIV-1 om nucleaire ingang te onderzoeken. Hiervoor werden verschillende structuren in de cel gekleurd zoals het nucleair porie complex, nucleaire lamina en het nucleaire membraan, dat via onze tri-functionele labels kan worden gekleurd. Daarnaast werd ook een nieuwe variant van het standaard expansie microscopie protocol getest om de expansie factor nog meer te verhogen en dus ook de resolutie.

In conclusie, expansie microscopie werd gebruikt als een slim hulpmiddel om verschillende biomoleculen te onderzoeken in aparte cellen. Dit maakte het mogelijk voor ons om een hele waaier aan biologische vragen te bestuderen op nanometer schaal via standaard diffractie gelimiteerde microscopen en met redelijk simpele aanpassingen aan het originele expansie protocol.