Impact van Zeb2 op specificatie, zonatie en regeneratie van lever sinusoïdaal endotheel

Lever-sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's) zijn een zeer gespecialiseerd type endotheelcellen (EC's) die worden gekenmerkt door een hoge permeabiliteit als gevolg van de aanwezigheid van transcellulaire poriën, fenestraties genoemd, een slecht ontwikkeld basaalmembraan, en hoge expressieniveaus van wegvangende receptoren. Vanwege deze hoge permeabiliteit en hun positie op het grensvlak tussen bloed en hepatocyten, fungeren LSEC's als een selectieve filter van het bloed, waardoor transport van voedingsstoffen naar de hepatocyten mogelijk is en tegelijkertijd afvalstoffen en binnendringende pathogenen worden opgeruimd. Tegelijkertijd maakt hun strategische positie LSEC's ook kwetsbaar, wat wordt weerspiegeld door hun snelle dedifferentiatie tijdens chronische leverziekte naar een continu capillair EC-fenotype, een proces dat bekend staat als capillarisatie, vergezeld van LSEC-disfunctie. LSEC-capillarisatie is een belangrijke katalysator van de progressie van chronische leverziekte. Hoewel het herstellen van de LSEC-specialisatie een veelbelovende strategie is voor chronische leverziekten met verschillende etiologieën, staat het begrijpen van de moleculaire regulatie ervan nog maar in de kinderschoenen.

Het meest voorkomende type chronische leverziekte is tegenwoordig niet-alcoholische leververvetting (NAFLD). NAFLD heeft wereldwijd een prevalentie van ~30%. Vanwege de nauwe relatie met het metabool syndroom en obesitas neemt de prevalentie ervan echter nog steeds toe. NAFLD is verantwoordelijk voor 4% van alle sterfgevallen en wordt de belangrijkste oorzaak van levertransplantaties. Helaas bestaan er geen effectieve farmacologische behandelingen, waardoor patiënten worden overgegeven aan ondersteunende therapie en aanmoediging voor gewichtsverlies en leefstijlinterventies. NAFLD vertegenwoordigt een spectrum van chronische leverziekten, bestaande uit steatose in de beginfase, die kan evolueren naar de inflammatoire fase van niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), die fibrose veroorzaakt. In het eindstadium van chronische leverziekte ontstaat cirrose, gekenmerkt door angiogenese om portaal-systemische shunts en regeneratieve knobbeltjes te vormen. LSEC's zijn betrokken bij alle belangrijke pathologische processen van de progressie van chronische leverziekte, via cel autonome en niet cel autonome mechanismen.

Transcriptiefactor ZEB2, goed beschreven in ontwikkeling en kanker vanwege zijn rol in respectievelijk neuronale differentiatie en endotheel-naar-mesenchymale transitie, was een van de transcriptiefactoren die eerder door mijn gastlaboratorium werden geïdentificeerd als een potentiële regulators van LSEC-specialisatie vanwege de verrijking ervan in lever vergeleken met hart- en hersen-EC's. We besloten te onderzoeken of ZEB2 inderdaad belangrijk is voor LSEC-specialisatie tijdens basale omstandigheden, fibrose en steatose. Daarom hebben we de ZEB2-expressie specifiek gemanipuleerd in EC's van EC-specifieke Zeb2 knock-out (ECZeb2KO) of overexpressie (ECOE) muizen. Om de rol ervan tijdens chronische leverziekte te bestuderen, hebben we een door toxines geïnduceerd fibrosemodel en een door westers dieet (WD) geïnduceerd model van NAFLD gebruikt.

Sequencing van lever-EC-RNA vroeg na het verwijderen van ZEB2 onthulde een toename van continue EC-markers, wat suggereert dat Zeb2-deficiënte LSEC's gevoeliger zijn voor dedifferentiatie en capillarisatie. Na ZEB2-deletie verdwenen de fenestraties echter niet. Terwijl functionele annotatie op differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) 2 weken na inductie met tamoxifen verhoogde bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF)-B-signalering en angiogenese liet zien, maar geen proliferatie, was verhoogde proliferatie de overheersende functionele annotatie 6 weken na Zeb2-deletie, wat waarschijnlijk een weerspiegeling is van verschillende vormen van angiogenese veroorzaakt door endotheliale Zeb2-deletie. Hiermee gepaard ging een uitbreiding van het vasculaire oppervlak en de aanwezigheid van pilaartjes in de levervaten van ECZeb2KO gaf aan dat dit waarschijnlijk te wijten was aan verhoogde splitsende angiogenese. Hoewel shRNA-gemedieerde ZEB2-knockdown in HUVECs de proliferatie niet beïnvloedde, beïnvloedde het wel het aantal vertakkingspunten en vertakkingslengte gevormd door HUVECs, die parameters zijn die eerder geassocieerd zijn met kiemende angiogenese. Samenvattend hebben we ZEB2 geïdentificeerd als een nieuwe multimodale regulator van LSEC-identiteit.

Veranderingen in de endotheliale expressie van liganden die mogelijk betrokken zijn bij het in rust houden van hepatische stellaatcellen (HSC), samen met significante veranderingen in het expressieprofiel van HSC's, toonden aan dat Zeb2 de LSEC-HSC-communicatie en HSC-activering reguleert. Dienovereenkomstig vertoonden de levers van ECKO-muizen bij blootstelling aan het hepatotoxine koolstoftetrachloride (CCl4) verhoogde capillarisatie, HSC-activering en fibrose vergeleken met levers van wildtype (WT) nestgenoten. Het vasculaire onderhoud en de anti-fibrotische rol van Zeb2 in EC’s werd bevestigd in ECOE-muizen, omdat de laatste resulteerde in verminderde vascularisatie en CCl4-geïnduceerde leverfibrose.

Om de rol van ZEB2 in LSECs tijdens NAFLD te bestuderen, hebben we ECZeb2KO-muizen een WD- of standaarddieet (SD) gegeven. In gezonde en zieke WT-levers werd Zeb2 alomtegenwoordig en op vergelijkbare wijze tot expressie gebracht in de bloedvasculaire EC’s. Uit RNA-sequencing van lever-EC’s bleek dat Zeb2-deficiëntie grote veranderingen in de genexpressie teweegbrengt vergelijkbaar met die veroorzaakt door kortdurende WD-voeding. Functionele annotatie op DEG's onthulde dat deze veranderingen in genexpressie gerelateerd zijn aan celdeling en Rho GTPase-signalering. Immunofluorescentiekleuring voor KI67 bevestigde een verhoogde proliferatie in LSEC's na ZEB2-verlies, WD-voeding of de combinatie van beide. Bovendien werkten endotheliale ZEB2-verlies en WD-voeding samen om de capillarisatie te stimuleren, wat blijkt uit de sterk beïnvloede LSEC-markerexpressie. Functionele annotatie op DEG's die voortkomen uit de interactie van ZEB2-verlies en WD-voeding onthulde specifiek veranderingen in genexpressie gerelateerd aan 'peroxisoom proliferator geactiveerde receptor (PPAR) signalering' en de 'complement- en coagulatiecascade'. Dit laatste vertegenwoordigt een aspect van EC-disfunctie en werd aangetoond door verminderde F8-expressie en verminderde bloedstolling. Intrigerend genoeg onthulde de veranderde communicatie tussen LSEC's na gecombineerd endotheliaal ZEB2-verlies en WD-blootstelling vergelijkbare functionele gevolgen. Opmerkelijk is dat Peptidylarginine deiminase 4 (Padi4), het gen dat codeert voor een enzym dat voornamelijk wordt beschreven bij de vorming van neutrofiel extracellulair web, naar voren kwam als een gen kenmerkend voor vroeg stadium leverziekte met citrullinatie-activiteit geïnduceerd door kortdurende WD-voeding en ZEB2-verlies in LSEC's. Ondanks dat het verhoogde tekenen van LSEC-capillarisatie veroorzaakte, corrigeerde endotheliaal ZEB2-verlies uiteindelijk de door WD geïnduceerde hypovascularisatie van het leverparenchym, terwijl de gewichtstoename, leverbeschadiging en steatosis afnam.

Concluderend induceert endotheliaal ZEB2-verlies LSEC-capillarisatie en angiogenese tijdens fysiologische omstandigheden. In de context van door toxines geïnduceerde leverfibrose versnelt ZEB2-verlies in EC's de fibrogenese van de lever, terwijl het de ontwikkeling van steatose vermindert in een model van NAFLD. Tijdens NAFLD vermindert endotheliale Zeb2-deficiëntie de ontwikkeling van steatosis mogelijk door het LSEC-vetmetabolisme te stimuleren. Vanwege de contextafhankelijke rol van ZEB2 in EC’s is verder onderzoek nodig om te ontcijferen of remming of stimulatie van ZEB2 het gunstigst zou zijn voor de uitkomst van de ziekte, voordat ZEB2 en ZEB2-afhankelijke genen in lever-EC's worden benut om nieuwe therapeutische strategieën voor leverfibrose of -steatose te ontwerpen.