Geneesmiddel-gemedieerde modulatie van hepatische galzouttransportproteïnen

Transportproteïnen (transporters, carriers) spelen een belangrijke rol in de dispositie van zowel endogene als exogene moleculen en hebben daarbij een impact op de veiligheid en werkzaamheid van vele geneesmiddelen. Dit wordt duidelijk wanneer geneesmiddelen interfereren met de functie van transportproteïnen, hetgeen kan leiden tot interacties tussen geneesmiddelen onderling of tussen geneesmiddelen en endogene verbindingen (bv. galzouten). Het nagaan of een potentieel nieuw medicijn een bepaald transportproteïne remt, wordt verwacht op basis van richtlijnen van verschillende regelgevende instanties vooraleer een molecule op de markt gebracht mag worden. Naast het direct effect op de farmacokinetiek en de toxicologische relevantie werd reeds aangetoond dat transportproteïnen farmacologische doelwitten zijn.

In de lever is NTCP (Na/Sodium Taurocholate Co-transporting Polypeptide) het belangrijkste transportproteïne verantwoordelijk voor de opname van galzouten uit het bloed. De ontdekking dat NTCP als receptor van het hepatitis B virus (HBV) dient, heeft het zoeken naar remmers van de opname (“entry blockers”) van het HBV in levercellen bevorderd. Het werd duidelijk dat liganden van NTCP ook virusopname konden voorkomen. Gezien de bestaande therapieën niet in staat zijn om het virus volledig uit te roeien, zouden entry blockers de huidige therapeutische opties kunnen aanvullen. Aan de canaliculaire zijde van de levercel transporteert BSEP (Bile Salt Export Pump) bijna exclusief de galzouten naar de gal. Het werd al aangetoond dat inhibitie van BSEP kan leiden tot geneesmiddel-geïnduceerde cholestase (drug-induced cholestasis, DIC), hetgeen in ieder geval te vermijden is bij de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Bijgevolg vormt de overlap in substraat-specificiteit tussen NTCP en BSEP een belangrijke uitdaging tijdens de ontwikkeling van NTCP-inhibitoren als nieuwe antivirale geneesmiddelen.

BSEP-inhibitie is een welgekend mechanisme dat aan de basis ligt van DIC. Desalniettemin is galzouthomeostase een complex proces waarbij niet alleen transportproteïnen, maar ook enzymen en nucleaire receptoren betrokken zijn. Daarnaast kan een potentiële BSEP-inhibitor zijn activiteit alleen uitoefenen als de bereikte ongebonden concentraties aan de bindingsplaats van BSEP voldoende hoog zijn. Humane hepatocyten in sandwich configuratie (sandwich-cultured human hepatocytes, SCHH) worden aanzien als de gouden standard om DIC te detecteren in vitro. Ze bewaren transportproteïne- en enzymexpressie en vereisen dat testverbindingen het intracellulaire compartiment bereiken. Bosentan, een gekend cholestatisch middel in mensen, veroorzaakte geen cholestase in preklinische dierenproeven. Het is nog steeds op de markt, maar kreeg een “FDA black box warning” en vereist het monitoren van de leverfunctie tijdens de behandeling. Ondanks dat in vitro BSEP-inhibitie voorheen werd aangetoond, veroorzaakte bosentan geen cholestase in onze SCHH-gebaseerde DIC-test. Andere mechanismen dan BSEP-inhibitie moeten dus betrokken zijn bij bosentan-geïnduceerde veranderingen in galzouthomeostase, alsook DIC in patiënten. 

Het algemene doel van dit doctoraatsonderzoek was om nieuwe farmacologische en toxicologische inzichten te verwerven met betrekking tot de hepatische galzouttransportproteïnen NTCP en BSEP, respectievelijk. De specifieke objectieven waren: (1) het identificeren van nieuwe NTCP-inhibitoren die gebruikt zouden kunnen worden voor de behandeling van chronische HBV infectie. (2) Het ontwikkelen van een gevoelige BSEP-inhibitietest, gebruik makend van glycocholzuur (GCA) als substraat, met de bedoeling om BSEP-inhibitie te detecteren bij NTCP-inhibitoren. (3) Het kwantificeren van het effect van therapeutisch relevante bosentan concentraties op galzoutdispositie in SCHH.

In het eerste deel van dit werk (Hoofdstuk 3), evalueerden we meer dan 2500 verbindingen voor hun inhiberend potentieel ten opzichte van NTCP in vitro. We gebruikten een gemakkelijke en reproduceerbate test gebaseerd op NTCP-getransfecteerde Chinese-hamster-eierstokcellen en tauro-nor-THCA-24-DBD als fluorescerend substraat. Dertig verbindingen vertoonden concentratieafhankelijke inhibitie van NTCP. De inhibitiedata werd gebruikt om een overlappend (overlay) en virtueel screeningsmodel te maken. Het overlappend model bestaat uit een hydrofobe kern, omgeven door hydrofiele groepen en bijkomende hydrofobe groepen die interageren met NTCP. Dit is in overeenstemming met voorheen gepubliceerde modellen voor NTCP-substraten en inhibitoren. Belangrijk is dat een aniongroep ontbrak in ons overlappend model dat wel aanwezig is in het substraatmodel. Dit is een aanwijzing dat afwezigheid van deze groep een gewenste eigenschap van NTCP-inhibitoren kan zijn. Vervolgens hebben we onze modellen toegepast op de ChEMBL database. Bijkomende NTCP-inhibitoren werden geïdentificeerd in silico waarvan de activiteit werd bevestigd in vitro. Onze modellen werden daarmee gevalideerd en kunnen bruikbaar zijn in de industrie.

Om het BSEP inhiberend potentieel van onze NTCP-inhibitoren te bepalen, hebben we een gevoelige en reproduceerbare in vitro test ontwikkeld (Hoofdstuk 4). We gebruikten binnenstebuitengekeerde membraanvesikels, bekomen van BSEP-getransfecteerde HEK293 cellen en niet-radioactief GCA als substraat. Deze unieke combinatie laat toe om GCA te kwantificeren aan zeer lage concentraties met vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie en zonder de nadelen van het gebruik van een radioactief substraat. Terwijl sommige NTCP-inhibitoren potente BSEP-inhibitoren bleken te zijn, hadden anderen geen effect op BSEP. Dit is een aanwijzing dat het mogelijk is om een onderscheid te kunnen maken tussen NTCP- en BSEP-inhibitie. We hebben de test ook gebruikt om bosentan en zijn metabolieten te beoordelen. We ontdekten dat desmethylbosentan een sterkere BSEP-inhibitor was dan bosentan, daarbij waarschijnlijk bijdragend aan het cholestatisch effect van bosentan. De IC50 waarden waren 56.5 microM en 162.0 microM, respectievelijk. Hydroxybosentan en hydroxydesmethylbosentan inhibeerden BSEP met IC50 waarden van 461.5 microM en 512.4 microM, respectievelijk. Hun bijdrage tot bosentan-geïnduceerde cholestase wordt verwacht beperkt te zijn.

Ondanks dat BSEP-inhibitie een cruciale factor is in DIC, zijn er ook andere factoren betrokken bij de ontwikkeling van DIC voor een bepaalde verbinding. Dit wordt geïllustreerd door bosentan. Eerder uitgevoerd onderzoek door onze groep toonde aan dat bosentan niet cholestatisch was in vitro bij supratherapeutische concentraties tot 200 microM. In Hoofdstuk 5 hebben we het effect van bosentan aan therapeutisch relevante concentraties op de omgang met galzouten onderzocht in SCHH. Bosentan verminderde zowel de endogene intracellulaire als extracellulaire glycochenodeoxycholzuur (GCDCA) als GCA hoeveelheden in SCHH. Onze hypothese was daarom dat bosentan zowel de novo synthese van galzouten als conjugatie van ongeconjugeerde galzouten inhibeert. In een tweede fase van dit werk werden SCHH blootgesteld aan exogeen chenodeoxycholzuur (CDCA) in aan- en afwezigheid van bosentan. We observeerden een gereduceerde intracellulaire en canaliculaire GCDCA accumulatie met een verschuiving naar sinusoïdale efflux van GCDCA terwijl de hoeveelheden van CDCA onveranderd bleven. We ontwikkelden een mechanistisch model dat het effect van bosentan op CDCA en GCDCA kwantificeert. Het model bevestigde het inhiberend effect van bosentan op canaliculaire GCDCA klaring. Dit onderzoek bezorgde ons inzicht in de galzoutveranderingen geïnduceerd door bosentan aan klinisch relevante concentraties. De verminderde vorming van GCDCA en verschuiving naar sinusoïdale efflux van GCDCA zou deze observaties kunnen verklaren.

Dit doctoraatsonderzoek verschafte kennis met betrekking tot het effect van small molecules op de hepatische transportproteïnen NTCP en BSEP. Aan de hand van in vitro en in silico methoden werden nieuwe NTCP-inhibitoren geïdentificeerd, wat zou kunnen leiden tot een nieuwe behandelingsoptie voor chronische HBV-infectie. Het chemometrisch model zou interessant kunnen zijn voor de industrie om bijkomende NTCP-inhibitoren te identificeren en verifiëren. Een gevoelige en reproduceerbare BSEP-inhibitietest werd ontwikkeld. Verschillende NTCP-inhibitoren inhibeerden gelijktijdig BSEP waardoor het risico op het ontwikkelen van DIC verhoogt. Gebaseerd op de substraat overlap tussen NTCP en BSEP, stellen we voor om inhibitie van BSEP uit te sluiten onder de NTCP-inhibitoren. We evalueerden bosentan en zijn drie belangrijkste metabolieten in de mens in onze BSEP-inhibitietest. Desmethylbosentan bleek een meer potente inhibitor te zijn dan bosentan. Blootstelling van SCHH aan therapeutisch relevante bosentan concentraties veroorzaakte veranderingen in zowel endogene als exogene galzouten. Uit het mechanistisch model bleek de galklaring van GCDCA het overheersende mechanisme te zijn, verantwoordelijk voor de gereduceerde GCDCA hoeveelheden in de canaliculi. Bovendien observeerden we een gereduceerde intracellulaire GCDCA hoeveelheid wat het resultaat kan zijn van directe inhibitie van CDCA conjugatie met glycine, wat kan bijdragen tot dit effect. Verder onderzoek naar andere mechanismen betrokken bij bosentan-geïnduceerde cholestase is nodig en zou de basis kunnen leggen voor nieuwe biomarkers voor DIC.