Een nieuwe methode om BYD virus susceptibiliteitsgenen te identificeren en de duurzame cultivatie van tarwe te verbeteren

Tegenwoordig is er een groeiende interesse om de functionele eigenschappen van RNA-bindende eiwitten (RBP) in een grote verscheidenheid aan organismen te bepalen en onderzoeken. Voor dit doel zijn er recent verschillende nieuwe RNA-centrisch georiënteerde technieken ontwikkeld. De meeste van deze nieuwe methodologieën zijn geoptimaliseerd op eencellige organismen en/of licht doorlatende staaltypes maar zijn moeilijk toepasbaar op meer gestructureerde staaltypes zoals plantaardig materiaal. Hoewel de isolatie van het poly(A)-bevattende RBPome goed onderzocht is met behulp van de RNA Interactome Capture (RIC) technologie, ontbrak bij de start van ons project nog een algemene methode om het volledige RBPome te isoleren. Daarbovenop, succesvolle pogingen om de RBP's van een specifiek RNA molecule (specifieke RNP’s) te identificeren zijn nog steeds zeldzaam in de literatuur en, indien aanwezig, vaak niet bedoeld voor routinematig gebruik vanwege hun hoge kosten en vereiste opschaling. Daarom zullen we in dit manuscript deze weefsel- en poly(A)-afhankelijkheid van de huidige RBPome-isolatiemethoden aanpakken, samen met het aanbieden van een specifieke RNP isolatie procedure die kostenefficiënt, gebruiksvriendelijk met standaard laboratoriumapparatuur en breed toepasbaar voor routineonderzoek is. Als einddoel streven we ernaar om onze ontworpen technieken toe te passen ter identificatie van planteigen RBP's die de levenscyclus van virussen beïnvloeden om nieuwe pro- en antivirale eiwitten te ontdekken. Deze kunnen vervolgens gebruikt worden bij de veredeling van virale resistentie in de plant.

Eerst werd een nieuwe procedure, genaamd SAPS (Silica and Acidic Phase-Separation), uitgewerkt om een kwalitatief plant RBPome te isoleren en identificeren. Deze methode was gebaseerd op de eigenschappen van silica om RNA te binden en acidic guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC)  om RBP-complexen te extraheren en scheiden van contaminanten. Deze innovatieve methode stelde ons in staat om de RBP's efficiënt en zuiver te isoleren. Onze methodologie resulteerde in de isolatie van een Arabidopsis RBPome van gelijkaardige kwaliteit als de recent gepubliceerde plant RIC-methode. Bovendien zou SAPS breder dan RIC kunnen worden toegepast omdat SAPS niet discrimineert op enkel RNA-moleculen die een poly(A)-staart bevatten. Belangrijk, dankzij het eenvoudig opschalende karakter en de mogelijkheid om het isolaat op te lossen in een buffer van keuze, is het SAPS isolaat ook een goed startpunt om meerdere RNA- en eiwit-centrische technieken op toe te passen voor een verdere en diepgaandere studie van de verrijkte RBP’s.

Omdat in plantaardig materiaal RNA en hun interagerende eiwitten vaak moeilijk met UV licht covalent te verbinden zijn, werd SAPS toegepast op met stikstof bevroren en verpoederd plantaardig materiaal. Met deze methode konden meer RBP's geïdentificeerd worden en werd het RBPome minder beïnvloed door artefacten van de anders ingrijpende UV behandeling. Na het toepassen van een tussentijdse versie van onze SAPS-procedure op TRV (tabaksratelvirus ) en TMV (tabaksmozaïekvirus) geïnfecteerde Nicotiana benthamiana materiaal, werd het duidelijk dat het vervangen van de silica kolommen van de InviTrap Spin plant RNA kit door de gemakkelijker schaalbare TRAPP-procedure resulteerde in een duidelijk hogere kwaliteit en kwantificeerbaarheid van het geïsoleerde RBPome. Deze voorlopige SAPS-procedure stelde ons tevens in staat om een aantal potentieel interessante RBP's te identificeren die in de literatuur kunnen worden teruggekoppeld aan virale plant infectie en bevestigde daarmee onze aanpak om gastheereiwitten te identificeren die noodzakelijk zijn voor een succesvolle virale infectie van planten. Daaropvolgend werd de Virus-Induced Gene Silencing (VIGS)-techniek gebruikt om het effect van een verminderde transcriptie van de door SAPS-geïdentificeerde ATP-dependent RNA-helicase DBP2/DED-1, chaperonne HtpG en calreticulin (CRT) eiwitten op de TRV cyclus in N. benthamiana te bestuderen. Er werden echter nog geen duidelijk significante resultaten verkregen, vanwege de grote variatie tussen de individuele stalen. Wij zijn daarom van mening dat het gebruik van een recent geoptimaliseerd N. benthamiana CRISPR-protocol in de toekomst een beter beeld zou moeten kunnen geven van dergelijke validatie experimenten.

Ten slotte hebben we een RNA-centrisch specifieke RNP-isolatieprocedure gebruikmakend van standaard laboratorium apparatuur ontwikkeld om betrouwbaar en kostenefficiënt RNPs te isoleren. Om dit te verwezenlijken werd de RNA anti-sense isolatie gevolgd door massa spectrometrie identificatie (RAP-MS) gebruikt en aangepast. De belangrijkste optimalisaties waren gericht op zowel de zuiverheid als de opbrengst van het isolaat. Hiervoor werden de gebruikte gebiotinyleerde probes ontwikkeld om hoge temperaturen (65°C) te weerstaan zodat er tijdens de “vang stap” minimale contaminatie in het isolaat achter bleef. We hebben ook vastgesteld dat de verhouding van de probes-target en beads-probes de opbrengst sterk kan beïnvloeden. Voor een optimale opbrengst wordt dan ook aangeraden om de hoeveelheid target in het staal op voorhand te bepalen en hier de hoeveelheid probes en beads aan aan te gepast. Bovendien werkt de RAP-MS techniek beter op een reeds voorgezuiverd RNP staal zoals het SAPS isolaat. Door de interessante eigenschappen van SAPS zoals het verminderen van de staalvolumes en het verwijderen van ongebonden target RNA kunnen de kosten van de techniek drastisch verlaagd worden door de lagere hoeveelheid benodigde streptavidine gekoppelde beads en andere chemicaliën. Vergeleken met de oorspronkelijke RAP-MS-procedures werden de besparingen van onze techniek geschat op een 50-voud. Uiteindelijk zijn we erin geslaagd om TRV RNP's te isoleren (met een zuiverheid van meer dan 99%) en visualiseren met silverstain. Dit geeft aan dat er theoretisch voldoende RBP’s geïsoleerd werden om te identificeren met de massa spectrometrie analyse en zal als eerstvolgende stap uitgevoerd worden.

Samengevat zullen de hierboven beschreven ontwikkelde technieken de identificatie van RNA bindende eiwitten in moeilijk te UV-crosslinken materie bevorderen. Hierdoor, zal zowel het RBPome als specifieke RNP’s van zowel virus geïnfecteerd plantenweefsels als ook organismen die nog niet toegankelijk waren met de conventionele technieken onderzocht kunnen worden. Bovendien zijn de kosten van onze isolatieprocedures (SAPS en de gerichte RNP isolatie) beduidend lager en uitvoerbaar met standaard laboratorium apparatuur waardoor deze breed toepasbaar zijn voor tal van toekomstige onderzoeksdoeleinden.