Ontwerp en ontwikkeling van een nieuw platform voor CXCR4-gerichte moleculaire beeldvorming en radionuclidetherapie

De CXC-chemokine receptor 4 (CXCR4) is een goed beschreven G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR) die betrokken is in verschillende fysio-pathologische processen na binding van zijn endogene ligand CXC-chemokine 12 (CXCL12). CXCR4 komt tot expressie tijdens de ontwikkeling en in volwassen organismen op verschillende celtypen, waaronder lymfocyten, endotheel, epitheel en hematopoëtische stamcellen (HSC’s). CXCR4 speelt een fundamentele rol bij hematopoëse, immuunrespons, neurogenese, kiemcelontwikkeling, cardiogenese en angiogenese. De CXCL12/CXCR4-as is ook een belangrijke schakel in de primaire tumorgroei en vorming van metastasen in kanker. Overexpressie van CXCR4 werd hierdoor beschreven bij meer dan 20 soorten humane kankers, gaande van solide tumoren tot hematologische maligniteiten. Bovendien, komt CXCR4 tot expressie op hematopoëtische cellen die betrokken zijn bij immuunrespons, waardoor hoge hoeveelheden CXCR4 worden waargenomen bij ontstekingshaarden. De multifunctionele rol van CXCR4 maakt het een interessant doelwit voor ontwikkeling van geneesmiddelen.

Niet-invasieve moleculaire beeldvorming wordt al tientallen jaren gebruikt voor diagnose. Met name 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]FDG) is de gouden standaard voor diagnostische positronemissietomografie (PET) beeldvorming van kanker en ontstekingen in de klinische praktijk. Hoewel [18F]FDG op grote schaal gebruikt wordt, mist het specificiteit omdat het bindt aan elk weefsel dat een verhoogd glucosemetabolisme heeft. Daarom is een radiofarmacon met hogere specificiteit voor cellen of weefsel die betrokken zijn bij bovenvermelde pathologieën van groot belang. Bijvoorbeeld, radiofarmaca gericht tegen CXCR4 zou de specificiteit van de beeldvorming kunnen verhogen en zou gebruikt kunnen worden voor diagnose en selectie van patiënten voor CXCR4-gerichte radionuclidetherapie (TRNT).

Tot dusver zijn [68Ga]PentixaFor en zijn therapeutische partner [177Lu]PentixaTher het beste theranostische paar in de klasse van CXCR4-gerichte radiofarmaca. [68Ga]PentixaFor wordt reeds klinisch gebruikt om hematologische kankers en atherosclerotische laesies op te sporen en de omvang van infarctweefsel na een acuut myocardinfarct (AMI) te bepalen. Bovendien wordt [68Ga]PentixaFor PET-beeldvorming gebruikt als leidraad voor de behandeling met [177Lu]PentixaTher. Ondanks het klinische potentieel van dit theranostische paar, kunnen de fysieke kenmerken van de diagnostische ligand en het farmacokinetische profiel van het therapeutische ligand nog verbeterd worden.

Met name voor 68Ga-gemerkte tracers is de klinische implementatie vaak beperkt vanwege de lage productieopbrengst, gerelateerd aan de huidige generatie 68Ge/68Ga-generatoren, de hoge kosten van deze generatoren en de relatieve korte halfwaardetijd (67,7 min) van gallium-68. Fluor-18 daarentegen combineert verschillende voordelen, zoals gunstige vervaleigenschappen, korte β+-weglengte (< 2 mm in water) en wordt gemakkelijk in grote hoeveelheden geproduceerd met een cyclotron. Bovendien, is de halfwaardetijd van 109.8 min lang genoeg voor meerstapssynthese, transport naar afgelegen ziekenhuizen die niet over een cyclotron beschikken, en een groter tijdsinterval tussen injectie en scannen, en toch kort genoeg om langdurige bestraling van patiënten te voorkomen. Pogingen om een geschikt fluor-18-derivaat te maken van [68Ga]PentixaFor waren helaas niet succesvol vanwege de uitgesproken gevoeligheid van de PentixaFor-structuur voor zelfs kleine structurele modificaties, wat leidde tot een sterk verminderde CXCR4-bindingsaffiniteit.

Verder, leidde de jodering van Tyr1 in [177Lu]PentixaTher tot een toename van lipofiliciteit in vergelijking met [68Ga]PentixaFor. Als gevolg hiervan is er een significante retentie van [177Lu]PentixaTher in de lever bij patiënten, tot zeven dagen na injectie (p.i.). Dit laatste beperkt de betrouwbaarheid van [68Ga]PentixaFor voor het voorspellen van de dosimetrie van [177Lu]PentixaTher aangezien [68Ga]PentixaFor niet in de lever wordt weerhouden.

Dit proefschrift beschrijft daarom de evaluatie van nieuw ontwikkelde vectorplatforms voor CXCR4-gerichte moleculaire beeldvorming en radionuclidetherapie die kunnen worden gemerkt met fluor-18 en therapeutische radionucliden, zonder het farmacokinetisch profiel van de verschillende radioliganden te veranderen.

DV1-k-(DV3) werd vanwege zijn unieke kenmerken als eerste geselecteerd als potentieel vectorplatform voor de ontwikkeling van een CXCR4-gerichte radiofarmacon. Het is een bivalent peptide dat volledig is samengesteld uit D-aminozuren en is afgeleid van de N-terminus van het virale macrofaag-inflammatoire eiwit-2 (vMIP-II), dat CXCR4 bindt met hoge affiniteit (half-maximale inhiberende concentratie, IC50: 3,0 nM).

De chemische structuur van DV1-k-(DV3) werd succesvol aangepast voor merking met verschillende radionucliden, voor zowel diagnostische als therapeutische doeleinden. Alle DV1-k-(DV3) gebaseerde liganden vertoonden een hoge in vitro bindingsaffiniteit voor humaan CXCR4 (hCXCR4) en muis CXCR4 (mCXCR4), zodat translationele beeldvorming van CXCR4-opregulering in preklinische tumor- en ontstekingsmodellen met deze speurstoffen potentieel mogelijk is. [18F]AlF-NOTA-DV1-k-(DV3) werd geproduceerd in een geautomatiseerde synthesemodule met behulp van een cGMP-compatibel Al18F-merkingsprotocol, wat toekomstige klinische implementatie vergemakkelijkt. De diagnostische radiotracers, [18F]AlF-NOTA-DV1-k-(DV3) en [68Ga]Ga-DOTA-DV1-k-(DV3), en hun therapeutische partner [177Lu]Lu-DOTA-DV1-k-(DV3), vertonen hetzelfde gunstig farmacokinetisch profiel in vivo. Verder werd de specifieke binding aan hCXCR4 en mCXCR4 in tumormuizen van [18F]AlF-NOTA-DV1-k-(DV3) bevestigd in vivo. De in vivo tumoropname van [18F]AlF-NOTA-DV1-k-(DV3) weerspiegelde echter niet de hoge in vitro bindingsaffiniteit voor hCXCR4 van AlF-NOTA-DV1-k-(DV3). Hoge bindingsaffiniteit van DV1-k-(DV3) voor mCXCR4 en de hoge expressie van mCXCR4 in de lever bij muizen bemoeilijken de evaluatie van het klinische potentieel van deze nieuwe klasse CXCR4-gerichte radiotracers.

Om de D-peptiden verder te verbeteren, ontwierpen we een nieuw D-peptide gebaseerd radioligand met verbeterde CXCR4-bindingsaffiniteit (IC50: 1,3 nM). Tijdens screening van DV1-k-(DV3) stelden we vast dat oxidatie van beide cysteïneresiduen in de DV1-sequentie resulteerde in volledig verlies van bindingsaffiniteit voor CXCR4. De matige tumoropname van [18F]AlF-NOTA-DV1-k-(DV3) zou daarom een gevolg kunnen zijn van in vivo oxidatie. Om dit te voorkomen, substitueerden we beide cysteïneresiduen in het nieuwe vectormolecule waarbij het nieuwe construct een hogere in vitro bindingsaffiniteit voor CXCR4 vertoonde. Hoewel we veronderstelden dat deze hogere bindingsaffiniteit van 2xDV1(c11sc12s) zou resulteren in verbeterde tumorbindingskinetiek, detecteerden we geen verschillen in tumoropname tussen [18F]AlF-NOTA-2xDV1(c11sc12s) en [18F]AlF-NOTA-DV1-k-(DV3). Bovendien leidde de verhoogde mCXCR4-bindingsaffiniteit van [18F]AlF-NOTA-2xDV1(c11sc12s) tot een nog hogere mCXCR4-specifieke accumulatie in de lever.

Hoewel we aanvankelijk aannamen dat de kruisreactiviteit van de D-peptiden tussen mens en muis CXCR4 voordelen zou hebben ten opzichte van de hCXCR4-selectiviteit van [68Ga]PentixaFor, leidde de hoge bindingsaffiniteit voor mCXCR4 tot lage concentraties van [18F]AlF-NOTA-2xDV1(c11sc12s) ter hoogte van het doelweefsel in zowel een hCXCR4-tumormuismodel als een mCXCR4-opgereguleerd inflammatie model. De hoge leverexpressie van mCXCR4 beperkt de klinische relevantie van de resultaten met [18F]AlF-NOTA-2xDV1(c11sc12s) in preklinische modellen. Aangezien CXCR4 niet tot expressie komt in een gezonde menselijke lever, zijn deze bevindingen bij muizen niet voorspellend voor de potentiële klinische waarde van deze nieuwe klasse van CXCR4-gerichte radiotracers. Daarom werd [18F]AlF-NOTA-2xDV1(c11sc12s) in een volgende stap geëvalueerd in een niet-humane primaat om de biodistributie van deze tracer in de mens te voorspellen. Verrassend genoeg vertoonde [18F]AlF-NOTA-2xDV1(c11sc12s) in deze studie een vergelijkbare biodistributie met hoge lever en nier retentie als in muizen.

Uit deze uitgebreide preklinische dataset kan worden geconcludeerd dat we een potentieel veelbelovend en veelzijdig platform hebben ontwikkeld voor CXCR4-gerichte moleculaire beeldvorming, maar dat enkel klinische evaluatie de waarde van deze radiofarmaca verder kan bepalen. We voeren daarom momenteel de eerste klinische studie uit met [18F]AlF-NOTA-2xDV1(c11sc12s) om de klinische prestatie te evalueren en te vergelijken met [68Ga]PentixaFor.

Om de moeilijkheden veroorzaakt door de kruisreactiviteit tussen mens en muis CXCR4 te voorkomen, selecteerden we twee extra vectormoleculen die selectief binden aan h CXCR4. De radioactief gemerkte nanobodies (Nbs), VUN400 en VUN401, vertoonden hierbij gunstige in vitro bindingseigenschappen. Tijdens in vivo evaluatie in muizen, observeerden we echter een lage in vivo stabiliteit in plasma. De stabiliteit van de radioactief gemerkte constructen moet eerst geoptimaliseerd worden voordat we de volgende stappen in het ontwikkelingsproces kunnen zetten.

Over het algemeen beschrijven we een veelzijdig platform voor CXCR4-gerichte moleculaire beeldvorming met een breed scala aan toekomstige toepassingen. Het is duidelijk dat CXCR4 een interessant doelwit is voor (radio)farmaceutische ontwikkeling, maar waarvan de complexe interacties nog verder moeten worden opgehelderd om de rol van CXCR4 bij verschillende aandoeningen beter te begrijpen.