Hepatocyten met Heimwee Over de invloed van omgevingsfactoren en de geassocieerde deregulatie van YAP/TAZ op de dedifferentiatie van in vitro gekweekte hepatocyten

Deze thesis bestaat uit twee aparte delen. In een eerste deel zal ik de rol van de Hippo pathway in stamcellen en stamcel-gederiveerde levercellen beschrijven. In het tweede deel, behandel ik een theoretische studie van de celcyclus.

Deel I

Primaire humane levercellen (voornamelijk hepatocyten, maar ook stellaatcellen) blijven het standaard in vitro model voor het bestuderen van leverziektes en toxiciteit van medicijnen. Omdat deze cellen echter moeilijk te bekomen zijn, wordt er sterk naar alternatieven gezocht. Eén zo’n alternatieve optie zijn levercellen ontwikkeld uit pluripotente stamcellen (PSCn). Huidige differentiatieprotocollen geven echter vaak aanleiding tot levercellen die niet optimaal functioneren. PSC-gederiveerde hepatocyten bijvoorbeeld, beschikken niet over dezelfde capaciteit als primaire hepatocyten om medicijnen te metaboliseren, en ze repopuleren de lever van muizen minder efficiënt. Ook PSC-gederiveerde stellaatcellen hebben nadelen omdat deze een sterk geactiveerd fenotype vertonen.

Om bovenstaande problemen te verhelpen, ontwikkelde het Verfaillie lab hepatocyten uit PSCn die drie lever-specifieke transcriptiefactoren tot expressie brengen. Wanneer deze cellen (HC3x cellen genoemd) in geoptimaliseerd medium werden gedifferentieerd, vertoonden deze een betere functionaliteit dan klassieke PSC-gederiveerde hepatocyten: ze produceerden meer albumine en hadden hogere CYP3A4 activiteit. In een eerste deel van het resultaten hoofdstuk, beschrijven we hoe deze HC3x cellen spijtig genoeg niet in staat waren om de lever van muizen te repopuleren. Hoewel HC3x cellen dus efficiënter medicijnen metaboliseren dan standaard PSC-gederiveerde hepatocyten, verschillen ze nog steeds van primaire hepatocyten (deze laatste repopuleren muizenlevers immers wel efficiënt).

Eén factor die waarschijnlijk bijdraagt aan deze verschillen tussen primaire en PSC-gederiveerde hepatocyten zijn suboptimale biomechanische eigenschappen (cel-cel en cel-matrix interacties) van standaard celcultuur platformen. Hoewel de moleculaire principes niet volledig gekend zijn, speelt de verkeerde regulatie van de Hippo pathway mogelijks een belangrijke rol in dit hele proces. In een tweede deel van de resultaten, tonen we hoe analyse van RNAseq data aantoonde dat deze pathway inderdaad een andere activiteit vertoont in PSC-gederiveerde hepatocyten (ook in HC3x cellen) in vergelijking met primaire hepatocyten die niet in cultuur werden gebracht. Gebaseerd op deze bevindingen, ontwikkelden we verschillende strategieën om de activiteit van de pathway te manipuleren: het gebruik van ‘small molecules’ in het groeimedium, aanpassen van de celcultuur platformen, en het genetisch manipuleren van de cellen. Spijtig genoeg resulteerde geen van deze opties in ondubbelzinnige resultaten, en toekomstig werk is nodig om de exacte rol van de Hippo pathway in PSC-gederiveerde hepatocyten te achterhalen.

De Hippo pathway speelt niet enkel een rol tijdens de differentiatie van PSCn naar hepatocyten, maar ook in PSCn zelf of tijdens hun differentiatie naar stellaatcellen. In het laatste deel van het resultaten hoofdstuk, beschrijven we enkele bevindingen in deze celtypes, en gaan we dieper in op de redenen waarom ook deze resultaten niet tot nieuwe biologische inzichten hebben geleid (met een focus op het gebruik van doxycycline in genetisch gemanipuleerde cellen).

Deel II

Vermeerdering van het genomisch materiaal en verdeling ervan onder dochtercellen zijn twee processen die deel uitmaken van de celcyclus en fundamenteel zijn voor het overleven en de reproductie van vele organismen. De dynamische eigenschappen van de celcyclus, waarvan er één ‘bistabiliteit’ is, komen voort uit complexe eiwitinteracties in de cel. Zo zijn er bijvoorbeeld verschillende ‘feedback loops’ geïdentificeerd (zowel theoretisch als experimenteel) die aanleiding geven tot bistabiliteit van cycline afhankelijke kinases (CDKs). Deze laatste enzymen zijn essentieel voor de correcte coördinatie van de celcyclus. Meer recent werd ook aangetoond dat het CDK-tegenwerkende fosfatase PP2A-B55 bistabiliteit vertoont. Voorlopig zijn er minstens twee mechanismen beschreven in de literatuur die aan de oorsprong kunnen liggen van deze bistabiliteit. In deze thesis beschrijven we hoe we op basis van een massa-actie model deze twee mechanismen vergeleken hebben en experimentele perturbaties voorstellen die ons in de toekomst meer inzicht kunnen geven in de bistabiliteit van PP2A-B55.

Mechanistische massa-actie modellen omvatten vele moleculaire details, waardoor deze vaak afhankelijk zijn van een groot aantal variabelen en parameters. Als gevolg hiervan, zijn dit type modellen niet altijd even makkelijk te interpreteren, of kunnen de resultaten moeilijk veralgemeend worden. Eén manier om de complexiteit van zulke modellen te reduceren, is om de gedetailleerde reactiemechanismen te vervangen door functionele responscurven. Deze laatste kunnen beschreven worden aan de hand van wiskundige formules die meteen ook het kwalitatieve dynamische gedrag van het model omvatten. Deze manier van werken wordt vaak gebruikt voor zogenaamde ‘ultrasensitieve’ responscurven, die beschreven worden door middel van een Hill functie. S-vormige responsen, die vaak aangetroffen worden in bistabiele systemen, daarentegen, worden nauwelijks in modellen geïmplementeerd op zulke expliciete wijze. In het tweede deel van het resultaten hoofdstuk tonen we hoe een klassieke Hill functie kan aangepast worden zodat deze ook S-vormige responsen kan beschrijven. Deze fenomenologische methode reproduceert de resultaten van het embryologische celcyclus model uit deel één van het hoofdstuk, maar heeft het voordeel veel minder complex te zijn. Tot slot beschrijven we hoe het fenomenologische model ook bruikbaar is om de volledige celcyclus (inclusief restrictiepunt en DNA checkpoints) te modelleren als een opeenvolging van bistabiele switches.