Proces-geïnduceerde wijzigingen in structuur en functionaliteit van quinoaproteïnen

Het pseudograan quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) wordt reeds duizenden jaren gecultiveerd in het Andesgebied. Het laatste decennium nam de populariteit van quinoa ook in Westerse landen toe omwille van zijn potentieel als nutritioneel glutenvrij alternatief voor tarwe in graan-gebaseerde levensmiddelen. Daarenboven hebben quinoaproteïnen een gebalanceerde aminozuursamenstelling en worden ze beschouwd als een excellent plantaardig alternatief voor dierlijke proteïnen die rijk zijn aan albuminen en globulinen.

Om quinoa(proteïnen) toe te voegen aan bestaande levensmiddelen of nieuwe quinoa-gebaseerde levensmiddelen te ontwikkelen, is kennis vereist over de structurele en functionele eigenschappen van “native” quinoaproteïnen en de invloed van verwerkingsprocessen hierop. Wetenschappelijk onderzoek naar quinoaproteïnen is echter beperkt tot studies die gebruik maken van proteïne-isolaten bekomen na extractie bij alkalische pH (8.0-12.0) en precipitatie bij iso-elektrische pH (4.0-5.5). Ondanks de hoge proteïneopbrengst en zuiverheid die bekomen kan worden met zulke extractieprocedures, zorgen de extreme omstandigheden ook voor proteïnedenaturatie en bijgevolg gewijzigde functionele eigenschappen.

Met dit in het achterhoofd, had deze doctoraatsthesis als doel de impact van verhitten op de denaturatie-, aggregatie- en functionele eigenschappen van “native” quinoaproteïnen te onderzoeken. Gegeven het potentieel van quinoameel als plantaardig alternatieve proteïnebron in graan-gebaseerde levensmiddelen en de expertise van de onderzoeksgroep waar het uitgevoerd werd, steunt dit werk in grote mate op benaderingen die veel gebruikt worden in onderzoek naar graan-gebaseerde levensmiddelensystemen.

Eerst werd de extraheerbaarheid van proteïnen uit quinoameel onderzocht. De maximale proteïneopbrengst uit quinoameel was 82% en werd bekomen door gebruik te maken van het denaturerende agens natriumdodecylsulfaat (NDS) zowel in aan- als afwezigheid van het reducerende agens dithiothreitol (DTT) en eventueel in combinatie met een enzymatische of fysische voorbehandeling. Hieruit werd besloten dat inerte fysische barrières de extractie van ongeveer 20% van de proteïnen uit quinoameel verhinderen.

Om “native” proteïnen uit quinoameel te extraheren, werd een milde extractieprocedure met een hoge proteïneopbrengst en een beperkte proteïnedenaturatie ontwikkeld en geoptimaliseerd. Maximale proteïneopbrengst (64% van de totale proteïnen) in combinatie met minimale proteïnedenaturatie werd bekomen door quinoameel tweemaal (10 min) te extraheren met water en vervolgens tweemaal (10 min) met 0.4 mol/l natriumchloride. De gehaltes aan albuminen, globulinen, prolaminen en glutelinen waren respectievelijk 41-50, 7-11, 4-6, en 14-16% van de totale proteïnen in meel van vier quinoavariëteiten. Waterextracten bevatten meer dan 50% van de totaal extraheerbare proteïnen uit quinoameel. Dit waren zowel albuminen en globulinen omwille van het relatief hoge mineraalgehalte van quinoameel. Zowel chloroplastische en cytoplasmatische enzymen als legumine-achtige 11S en viciline­-achtige 7S globulinen werden geïdentificeerd. Bijgevolg werd besloten dat waterextracten geschikt zijn als referentie voor de totale “native” proteïnen in quinoameel.

Quinoazaden worden voornamelijk geconsumeerd na koken in overmaat water. Bovendien ondergaan levensmiddelen op basis van meel of proteïneconcentraten/isolaten meestal één of meerdere verwerkingsstappen zoals verhitten om het uiteindelijke product te bekomen. In een tweede deel van deze doctoraatsthesis werd daarom de hitte-geïnduceerde denaturatie en aggregatie van “native” quinoaproteïnen in waterextacten onderzocht. Hitte-geïnduceerde veranderingen in het gehalte aan totale en covalente proteïneaggregaten werden opgevolgd door de verminderde oplosbaarheid van proteïnen in respectievelijk water en een NDS bevattend medium te bepalen met behulp van een chromatografische scheiding op basis van grootte. Er werd aangetoond dat de verhittingstijd uitsluitend een invloed heeft op de mate van proteïne-aggregatie, terwijl de verhittingstemperatuur en pH ook het aggregatietype bepalen. Proteïnen in waterextracten aggregeerden enkel wanneer ze verhit werden bij pH 5,0 tot 7,0. Niet-covalente aggregaten werden gevormd wanneer verhit werd bij temperaturen lager dan 70 °C en een pH dichtbij het iso-elektrisch punt (pH 5,0) van globulinen. Waterstofbruggen, hydrofobe en elektrostatische interacties droegen samen bij tot de sterkte van deze niet-covalente aggregaten. Covalente aggregatie was maximaal wanneer gedurende 15 min verhit werd bij 100 °C en pH 7,0. Onder deze omstandigheden werden reeds na 1 min verhitten oligomere proteïnestructuren (ca. 100-500 kDa) gevormd die vervolgens verder polymeriseerden tot grotere structuren (> 500 kDa) na 5 min verhitten. Covalente aggregaten werden voornamelijk gevormd van 7S en 11S globulinen, hoofdzakelijk via disulfide (SS) verbindingen. 2S albuminen vormden daarentegen geen covalente aggregaten.

De hitte-geïnduceerde denaturatie en aggregatie van proteïnen in quinoazaden en -meel werd onderzocht in een derde deel van deze doctoraatsthesis. De beperkte mobiliteit van proteïnen in quinoazaden en hun aanwezigheid in proteïnelichamen zorgde ervoor dat een significant deel (tot 37%) van de proteïnen covalent aggregeerde wanneer zaden gedurende 15 min gekookt werden. Na dissociatie van de 11S globulinemonomeren tot hun zure en basische subeenheden vormden deze opnieuw grotere (> 500 kDa) covalente aggregaten, hoofdzakelijk via SS-verbindingen. 2S albuminen vormden geen covalente aggregaten, maar loogden deels uit in het kookwater. De aanwezigheid van zetmeel, dieetvezel en lipiden en/of hun structurele organisatie in quinoameel vertraagde de proteïnedenaturatie en verhinderde de proteïneaggregatie tijdens het koken. Globulinen dissocieerden nog steeds, maar aggregeerden minder en vooral kleine covalente aggregaten (ca. 100-500 kDa) werden gevormd tijdens het koken van quinoameel.

De structurele en functionele eigenschappen van proteïnen zijn sterk afhankelijk van elkaar. In een vierde deel werden de lucht-water (L-W) interfase- en schuimeigenschappen van “native” quinoaproteïnen in waterextracten geëvalueerd. Dit zijn belangrijke functionele eigenschappen tijdens bijvoorbeeld de brood- en cakebereiding. Schuimen van waterextracten bevatten zowel albuminen als 11S globulinen. Bij pH 7,0, wanneer zowel albuminen als globulinen in oplosbaar zijn, adsorbeerden ze samen aan de L-W interfase. Dichter bij het iso-elektrisch punt (pH 5,0) adsorbeerden enkel albuminen aan de L-W interfase, terwijl globulinen dispergeerden in de vloeibare film tussen de gascellen. Er werd besloten dat de structurele organisatie van de zure en basische subeenheden van het 11S globuline tot hun monomere, trimere of hexamere vorm voornamelijk de schuimcapaciteit van quinoawaterextracten bepaalt.

De hitte-geïnduceerde aggregatie van globulinen en bijgevolg aanrijking van albuminen zorgde ervoor dat de oppervlaktespanning van de L-W interfase toenam. Bovendien namen de visco-elastische eigenschappen van de L-W interfase af. Hoewel het proces van ontvouwen en interageren van proteïnen aan de L-W interfase verschillend is van dat van hitte-geïnduceerde proteïnedenaturatie en -aggregatie, werd gesuggereerd dat quinoa-albuminen niet interageren aan de L-W interfase maar zich na adsorptie eerder gedragen als colloïdale partikels. Bovendien adsorbeerden proteïneaggregaten niet aan de L-W interfase maar dispergeerden ze in de vloeibare film tussen de gascellen waardoor ze bijdroegen tot de sterische stabiliteit van schuimen. Er werd gesuggereerd dat geordende covalente aggregaten (gevormd bij pH 7,0) voor sterische stabiliteit zorgen, terwijl willekeurig gevormde niet-covalent aggregaten (gevormd bij pH 5,0) sterische instabiliteit veroorzaken.

Daarenboven werd in deze doctoraatsthesis aangetoond dat de eigenlijke proteïnesamenstelling van een gegeven quinoavariëteit een invloed heeft op de hitte-geïnduceerde denaturatie-, aggregatie- en schuimeigenschappen van quinoawaterextracten. Er zijn variëteitsafhankelijke verschillen in de stabiliteit van de SS-binding tussen de zure en basische subeenheden van het 11S globuline. Intacte 11S globulinemonomeren konden tijdens verhitten efficiënter covalente aggregaten vormen dan hun zure en basische subeenheden. Zure en basische subeenheden waren echter betere schuimvormers dan intacte 11S globulinemonomeren omwille van hun lage moleculair gewicht.

In een laatste deel werd aangetoond dat bij de bereiding van cream cake, tarwebloem en 50% (m/m) van de proteïnen in wit van ei succesvol vervangen kunnen worden door quinoameel. De aanwezigheid van eerder gevormde SS-gebonden proteïneaggregaten in quinoa-gebaseerde cakebeslagen had geen invloed op de hoeveelheid SS-verbindingen­ in de uiteindelijke cakes. Desondanks hadden de kruimstructuren van cakes waarvan de beslagen eerder gevormde SS-gebonden proteïneaggregaten bevatten, een lage cohesiviteit en weerstand en een hoge veerkrachtigheid.

Samengevat werden in deze doctoraatsthesis inzichten verworven over de hitte-geïnduceerde denaturatie-, aggregatie- en schuimeigenschappen van “native” quinoaproteïnen. Deze inzichten ondersteunen de ontwikkeling van nieuwe quinoa-gebaseerde levensmiddelen. Daarenboven bieden ze een kennisplatform aan voor verder onderzoek naar de structurele en functionele eigenschappen van “native” proteïnen in fylogenetisch verwante species zoals amarant (Amaranthus hypochondriacus), soja (Glycine max L.) en erwt (Pisum sativum L.).