Intratumorale gentransfer van immunomodulatoire antilichaamcombinaties: een preklinische proof-of-concept studie

Immuuncheckpoint-inhibitoren zijn uitgegroeid tot een nieuwe, veelbelovende behandelingsmethode voor kanker, aangezien deze monoklonale antilichamen een langdurige respons kunnen teweegbrengen in verscheidene vergevorderde en uitgezaaide tumoren. Toch reageert een groot deel van de kankerpatiënten niet op deze vorm van immuuntherapie, wat geleid heeft tot een zoektocht naar meer effectieve combinatiebehandelingen. Deze combinatiebehandelingen verhogen echter het risico op ernstige immuungerelateerde nevenwerkingen, een belangrijk nadeel van checkpoint-inhibitoren. Intratumorale antilichaamgentransfer kan een oplossing bieden voor deze uitdagingen. Hierbij worden de nucleotiden coderend voor de antilichamen rechtstreeks toegediend in de tumor, wat het lichaam in staat stelt om de antilichamen lokaal en voor een langdurige periode in vivo te produceren en secreteren. Intratumorale antilichaamgentransfer werd reeds meermaals uitgevoerd met virale vectoren, maar data met andere in vivo expressieplatformen, zoals mRNA en plasmide DNA (pDNA), waren nog niet gepubliceerd bij de start van dit doctoraatsproject. pDNA biedt verschillende voordelen ten opzichte van de andere platformen, waaronder een lagere immunogeniciteit, een hogere stabiliteit en een minder complex productieproces. De uiteindelijke expressie kan meer gematigd zijn, maar kan onder deze omstandigheden nog steeds effectief zijn, zoals bijvoorbeeld aangetoond in verschillende klinische studies van intratumorale DNA-gebaseerde toediening van het cytokine interleukine 12 (IL-12).

In dit doctoraatsproject beoogden we om preklinisch proof of concept aan te tonen voor intratumorale DNA-gebaseerde antilichaamgentransfer. Twee checkpoint-inhiberende antilichamen gericht tegen respectievelijk cytotoxische T lymfocyt-geassocieerd proteïne 4 (CTLA-4) en geprogrammeerde celdood proteïne 1 (PD-1) werden gebruikt als modelgeneesmiddelen.

Om de lage transfectie-efficiëntie van naakt pDNA te verhogen, hebben we eerst twee transfectiemethoden vergeleken die reeds worden toegepast in de kliniek voor intratumorale toediening van pDNA, namelijk elektroporatie en complexatie met het polykation in vivo-jetPEI (Hoofdstuk 3). In muizen met een MC38 tumor gaf intratumorale elektroporatie een meer robuuste, langdurige en tumorspecifieke expressie van een reporter eiwit. Bijgevolg werd elektroporatie gekozen als transfectiemethode voor alle daaropvolgende experimenten.

Vervolgens werden een DNA-gebaseerd anti-CTLA-4 antilichaam en DNA-gebaseerd anti-PD-1 antilichaam ontworpen en gevalideerd door middel van intramusculaire genelektrotransfer (Hoofdstuk 4). Optimalisatie van de antilichaamsequenties en expressiecassette verhoogde de antilichaamexpressie, resulterend in plasmaconcentraties tot respectievelijk 4 en 14 µg/ml voor het anti-CTLA-4 en anti-PD-1 antilichaam. De antilichamen bleven detecteerbaar gedurende minstens zes maanden, en significante tumorregressies werden teweeggebracht in het MC38 tumormodel. Intratumorale genelektrotransfer van de anti-CTLA-4 en anti-PD-1 antilichamen, zowel afzonderlijk als gecombineerd, leidde tot een gelijkaardige respons als de intramusculaire route (Hoofdstuk 4). De plasmalevels van de antilichamen waren echter tot 70-maal lager en voor een kortere periode detecteerbaar. Deze resultaten tonen aan dat intratumorale gentransfer mogelijks het risico op neveneffecten door de geproduceerde checkpoint-inhibitoren kan verminderen. Ondanks de beperkte systemische blootstelling aan de antilichamen leidde de lokale behandeling bovendien ook tot een systemische reactie, zoals bleek uit de impact op contralaterale, onbehandelde tumoren en de bescherming van muizen die genezen waren tegen een tweede tumorinjectie.

Tenslotte hebben we nagegaan of intratumorale genelektrotransfer kan toegepast worden voor de gelijktijdige toediening van checkpoint-inhiberende antilichamen en het cytokine IL-12 (Hoofdstuk 5). De DNA-gebaseerde combinatiebehandeling van het anti-PD-1 antilichaam, anti-CTLA-4 antilichaam en IL-12 verbeterde zowel de lokale als systemische respons in muizen met een MC38 tumor vergeleken met IL-12 alleen en met de combinatie van beide checkpoint-inhibitoren. In geëlektroporeerde tumoren werd een toename in infiltrerende T cellen, voornamelijk CD8+ T cellen, en een verhoogde expressie van CD8+ effectormerkers waargenomen, wat het immuungemedieerde karakter van de lokale respons bevestigde. Analyse van de milt toonde aan dat een algemene immuunactivatie, die kan leiden tot neveneffecten, afwezig was. Gentransfer van controleplasmiden, de checkpoint-inhibitoren of IL-12 alleen resulteerde in het B16F10 tumor model in een hoog percentage aan complete responsen. Dit bemoeilijkte de evaluatie van de drievoudige combinatie van het anti-PD-1 antilichaam, anti-CTLA-4 antilichaam en IL-12 in dit model.

Samengevat hebben we aangetoond dat DNA-gebaseerde checkpoint-inhiberende antilichamen doeltreffend lokaal kunnen toegediend worden door middel van intratumorale genelektrotransfer, zowel alleen als gecombineerd met andere biologische geneesmiddelen. Deze gentherapie methode kan een geschikt platform bieden om de ontwikkeling van andere veelbelovende (combinatie)therapieën die te toxisch zijn of te lage levels in de tumor bereiken na systemische toediening, te vergemakkelijken.