Ontwikkeling van proteomics workflows en studie van het secretiemechanisme via T3SS in Enteropathogene E.coli (EPEC)

Bacteriën hebben geavanceerde nano-machines ontwikkeld die hen in staat stellen gespecialiseerde functies uit te voeren. Onder deze zijn eiwitsecretiesystemen die de eiwittranslokatie van het celcytoplasma tot de extracellulaire omgeving mogelijk maken. Een daarvan is het type III eiwitsecretiesysteem (T3SS), een ~ 3-4 MDa structuur samengesteld door meer dan 20 eiwitten. T3SS penetreert beide membranen van Gram-negatieve bacteriën en breidt een naaldachtige structuur uit naar het celoppervlak. Eiwitsecretie via T3SS is sterk gereguleerd en het type secretorische eiwitten kunnen in drie sequentiële stappen worden ingedeeld: secretie van vroege substraten, translocatoren en effectoren. Deze hiërarchische volgorde van gebeurtenissen is essentieel voor de juiste bouw en functie van T3SS nanomachine. De toxinen verplaatsen zich door de samengestelde naaldstructuur rechtstreeks naar het cytoplasma van de gastheercel, waardoor de extracellulaire ruimte omzeild wordt.

Het grote aantal interactieve eiwitten, de lokalisatie van het systeem in twee membraan dubbele lagen en een strakke hiërarchische regulering van het afscheidingsproces van verschillende klassen substraten, introduceert een significante technische uitdaging in het uitlichten van het moleculaire mechanisme van T3SS-functie. Wij hebben een multidisciplinaire benadering gevolgd, waarbij methoden zoals moleculaire genetica, structurele biologie, cellulaire biologie, biofysica, in vitro reconstitutie en massaspectrometrie worden gecombineerd, waarbij op moleculaire wijze wordt gekeken naar 1) hoe secretaire eiwitten zijn getarget naar de T3SS, 2) welke T3SS eiwit(ten) fungeren als secretaire eiwitreceptoren en 3) hoe wordt het proces van hiërarchische overgang tussen substraten gereguleerd.

We ontleden het secretieproces in twee stappen: de eiwittargeting naar het membraan en de eiwitsecretie, en we richten ons alleen op de eiwittargeting stap. We beginnen met het bestuderen van de eerste stap van het secretieproces met behulp van het modelpaar chaperonne / secretaire eiwit-complex CesAB / EspA. We tonen aan dat de C-tail van CesAB fungeert als een membraangericht signaal dat de chaperonne, geladen met het substraat, naar het membraan leidt. We identificeerden de gate-keeper eiwit SepL als de belangrijkste interactiepartner voor CesAB / EspA complex op het membraan en we brachten de mogelijke interactiesites in kaart. We lokaliseren SepL aan de periferie van het translocase EscV en identificeerden hun interactiesites. Wij geven ook aanwijzingen voor substraatspecificiteitsregulatie van de gate-keeper eiwitten SepL en SepD, die aantonen dat, hoewel beide gate-keeper eiwitten SepL en SepD essentieel zijn voor EspA translocatie, verwijdering van SepD geen invloed heeft op SepL lokalisatie op het membraan en CesAB / EspA bindende affiniteit voor de T3SS injectisomen. We laten zien dat de gate-keeper eiwitten de bindingsaffiniteit van verschillende klasse translocator- (CesAB / EspA) of effectoreiwitcomplexen (CesT / Tir) regelen op de translocase EscV, met een niet volledig gedefinieerd mechanisme.

De gedetailleerde structurele en functionele karakterisering van T3SS regelgeving en secretie kan een breed scala aan toepassingen hebben. Verworven kennis kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van T3SS-specifieke analyses voor onderzoeken naar de ontdekking van geneesmiddelen en voor de doelgerichte techniek van het systeem voor eiwitsecretie, waardoor T3SS een interessant systeem is voor biomedisch en biotechnologisch onderzoek.