< Terug naar vorige pagina

Project

MERKELCELCARCINOOM, IDENTIFICATIE VAN NIEUWE MOLECULAIRE TARGETS EN ONTWIKKELING VAN EEN DRIEDIMENSIONAAL CELCULTUURMODEL

Merkelcelcarcinoom (MCC) is een zeldzaam cutaan neuro-endocrien carcinoom. Toch is de MCC incidentie de afgelopen jaren toegenomen en wordt voorspeld dat deze trend zich zal voortzetten. Bovendien is het met een algemeen sterftecijfer van 33-46% en een hoog percentage recidieven één van de meest agressieve vormen van huidkanker. Momenteel heeft MCC twee erkende etiologieën. Het Merkelcel polyomavirus (MCPyV) DNA wordt klonaal geïntegreerd in het genoom van de tumorcellen in ongeveer 80% van de MCC's van het noordelijk halfrond. MCPyV-positieve (MCPyV+) MCC's brengen constitutief twee virale oncoproteïnen tot expressie, de kleine (sT) en de grote (LT) tumorantigenen (TA's), die bijdragen aan de ongecontroleerde proliferatie van de getransformeerde cellen. Aangenomen wordt dat het MCPyV-negatieve (MCPyV-) subtype, dat het meeste voorkomt in Australië en Nieuw-Zeeland, ontstaat bij accumulatie van door UV-licht geïnduceerde somatische mutaties in proto-oncogenen en tumoronderdrukkers. Dit blijkt uit een hogere mutatielast van MCPyV- versus MCPyV+. In elk geval delen de twee subtypen van MCC oncogene mechanismen, zoals inactivering van het retinoblastoom-eiwit, wat de fenotypische overeenkomsten zou kunnen verklaren.

MCC is in de eerste plaats een ziekte van ouderen, hoewel de incidentie ook hoger is bij immuungecompromitteerde personen. Tot voor kort bestonden de klassieke behandelingsmodaliteiten uit chirurgie en radiotherapie voor lokale laesies of lokaal gemetastaseerde ziekte, en chemotherapie voor gemetastaseerd MCC. Toch waren de reacties op chemotherapie meestal van korte duur en gingen ze ten koste van een verhoogde algemene toxiciteit. Onlangs heeft de komst van immuuncontrolepuntremmers, zoals avelumab en pembrolizumab, de behandeling van patiënten met gemetastaseerde ziekte aanzienlijk verbeterd. Deze immuuncontrolepuntremmers veroorzaakten duurzame responsen en aanvaardbare toxiciteit, wat het belang van tumor-infiltrerende lymfocyten en de rol van de tumor-micro-omgeving in MCC-klinische uitkomst benadrukte. Hierdoor zijn immuuntherapieën de standaardbehandeling zijn geworden voor patiënten met gemetastaseerd MCC en wordt momenteel het gebruik ervan in eerdere stadia of als adjuvans onderzocht in klinische onderzoeken. Echter, ongeveer de helft van de patiënten reageert niet op de behandeling of ontwikkelt na een eerste reactie geen weerstand. Bovendien komt een groot deel van de patiënten, die immunosuppressief zijn of onder immuunsuppressieve behandeling staan, niet in aanmerking voor immunotherapie. Evenzo lijden oudere patiënten vaak aan andere comorbiditeiten of verschijnen de tumoren vaak op plaatsen, zoals het gezicht, die kwetsbaar zijn voor ingreep met chirurgie of radiotherapie. Dus is er een onvervulde behoefte aan de ontwikkeling van alternatieve therapeutische benaderingen om patiënten met MCC te behandelen die niet vatbaar zijn voor de huidige behandelingsmogelijkheden.

Zowel de virale sT als een afgeknotte vorm van de LT, die geen virale replicatie kan beginnen vanwege het ontbreken van de carboxyl (C)-terminale sequentie die het DNA-oorsprong bindend domein en de DNA-helicase-activiteit bevat, worden constitutief uitgedrukt in MCPyV+ MCC's. Het is aangetoond dat deze virale eiwitten een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van tumoren en bij het in stand houden van de proliferatie van MCPyV+ MCC-cellen. Hier wijst huidig bewijs op een meer overheersende rol van MCPyV sT bij het ontstaan van tumoren, terwijl wordt gesuggereerd dat het LT betrokken is bij het in stand houden van het oncogene fenotype. Experimenten met short hairpin-RNA's (shRNA's) gericht tegen de virale TA's toonden inderdaad aan dat MCPyV+ MCC-cellen de expressie van deze oncoproteïnen nodig hadden om de celgroei te behouden. Daarom veronderstelden we dat de meest geavanceerde tool voor het bewerken van genen die momenteel beschikbaar is, CRISPR/Cas9, zou kunnen worden gebruikt om de virale TA's aan te pakken en dus de groei van viruspositieve MCC's te belemmeren. We hebben deze benadering toegepast in twee MCPyV+ MCC-cellijnen, MS-1 en WAGA, door single-guide RNA's (sgRNA's) te ontwerpen die alleen gericht zijn op de LT of beide, sT en LT. Onze resultaten toonden aan dat deze CRISPR/Cas9 gebaseerde strategie een significante afname van LT-eiwitniveaus, verminderde celproliferatie en verminderde celcyclusprogressie veroorzaakte. Belangrijk is dat cellen die zijn getransfecteerd met een niet-doelgerichte sgRNA en HEK293T-cellen, die MCPyV- zijn, onaangetast bleven. Deze resultaten valideerden de eerdere rapporten over de rol van MCPyV TA's bij het in stand houden van de groei van MCC-cellen. Bovendien leverden deze bevindingen sterk bewijs voor de ontwikkeling van een CRISPR/Cas9 gebaseerde therapeutische benadering tegen MCPyV+ MCC.

Gerichte therapie presenteert zich als een aantrekkelijke benadering tegen de twee subtypen van MCC. Verschillende rapporten hebben aangetoond dat de PI3K/mTOR-route vaak wordt geactiveerd in MCC, ongeacht de virale toestand. Bijgevolg bleken MCC-cellijnen en xenotransplantaten gevoelig te zijn voor MLN0128, een dubbele mTOR1/2-remmer. Dit medicijn wordt momenteel klinisch onderzocht voor het gebruik bij de behandeling van MCC en andere solide tumoren. Hoewel het niet is gemeld dat de MAPK/ERK-route afwijkend geactiveerd is in MCC, is er sprake van cross-talk met de PI3K/mTOR-route en is compenserende activering grotendeels bewezen bij andere maligniteiten. Daarom hebben deze waarnemingen ons ertoe aangezet om de effecten te testen van het combineren van MLN0128 met trametinib, een MEK1/2-remmer die momenteel wordt gebruikt voor de behandeling van gemetastaseerd melanoom met de V600E- of V600K-veranderingen in het BRAF-eiwit. Een panel van drie virus-positieve en drie virus-negatieve MCC-cellijnen werd behandeld met combinaties van deze twee verbindingen. Zoals bepaald met de Chou-Talalay-methode, was de gecombineerde targeting synergetisch in de geteste MCC-cellen. Op die manier was een verlaagde dosis van elke remmer nodig om dezelfde werkzaamheid bij het remmen van celgroei te bereiken dan bij gebruik als enkelvoudig middel. Hoewel het precieze mechanisme dat betrokken is bij deze synergetische activiteit niet volledig is opgehelderd, lijkt de gecombineerde targeting van de PI3K/mTOR- en MAPK/ERK-routes een veelbelovende benadering te zijn om MCC te behandelen en om de beperkingen van enkelvoudige medicatieregimes met betrekking tot algemene toxiciteit te overwinnen en resistentie tegen geneesmiddelen.

Een van de belangrijkste hindernissen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen tegen MCC is de moeilijkheid om prospectieve klinische onderzoeken uit te voeren vanwege de zeldzaamheid en snelle evolutie van de ziekte. Bovendien ontbreekt het aan een model dat het proces van MCC-tumorigenese in vitro kan nabootsen. Hoewel cellijnen en door patiënten afgeleide xenotransplanten van MCC beschikbaar zijn voor onderzoek, vertonen ze bepaalde beperkingen vanwege de fysiologische verschillen tussen muizen en mensen. Bovendien zijn de huidige modellen, die virale oncoproteïnen tot expressie brengen in transgene dieren, niet volledig gelijkend op humane viruspositieve MCC’s. Om dit te onderzoeken, hebben we organotypische epitheliale vlotculturen (OERC's) van MCC ontwikkeld met behulp van primaire menselijke keratinocyten (PHK's) en zowel MCPyV+ als MCPyV-MCC-cellijnen gegroeid bovenop een kunstmatig dermaal equivalent. De differentiatie van de vlotten en de groei van MCC-cellijnen werd bevestigd door histologie en immunohistochemie. Normale PHK’s die groeien op een kunstmatig huidequivalent, stratificeren en differentiëren wanneer ze aan het lucht-vloeistofgrensvlak worden blootgesteld, waardoor een volledig gedifferentieerd epitheel wordt geproduceerd. Er werden belangrijke verschillen opgemerkt in het gedrag van de verschillende geteste MCC-cellijnen, zoals groeipatroon, invasiviteit en vereiste van keratinocyten om te prolifereren. Virus-positieve MCC-cellijnen groeiden over het algemeen uitsluitend bovenop het gedifferentieerde epitheel en vormden celclusters. Van de virusnegatieve MCC-cellijnen vertoonden enkel MCC14/2-cellen robuuste proliferatie, zelfs in afwezigheid van keratinocyten en wanneer ze in de kunstmatige dermis waren ingebed. Genexpressieanalyse van OERC's van co-culturen van MCC-cellijnen en PHK's onthulde dat sommige genen, die coderen voor verschillende specifieke soorten collagenen, anders tot expressie werden gebracht in vlotten van MCPyV+-cellen en vlotten van MCC14/2-cellen. Bovendien bleken verschillende moleculen in hoge mate tot expressie te komen in alle geanalyseerde OERC's (bijv. Matrix metalloproteïnasen die betrokken zijn bij de afbraak van de extracellulaire matrix en zo bijdragen aan celinvasie en migratie) en ze zouden kunnen dienen als potentiële doelen voor nieuwe MCC-behandelingen of als diagnostische biomarkers. Ondanks de noodzaak om dit model te standaardiseren en aan te passen aan high-throughput-analyse, vormen OERC's een geschikt instrument voor het evalueren van de werkzaamheid en selectiviteit van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen tegen MCC. Bovendien kunnen ze mogelijk worden gebruikt om de moleculaire gebeurtenissen te bestuderen die MCC aansturen.

Samenvattend biedt het werk dat in dit proefschrift wordt gepresenteerd nieuwe inzichten in het begrip van MCC en de basis voor het onderzoek van nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van patiënten die aan deze maligniteit lijden, hetzij alleen, hetzij in combinatie met de huidige behandelingsmodaliteiten. Bovendien zal de vooruitgang in de ontwikkeling van OERC's clinici en onderzoekers nieuwe middelen bieden om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen tegen MCC te testen en om licht te werpen op de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij tumorigenese.

Datum:9 nov 2015 →  14 dec 2020
Trefwoorden:Tumor microenvironment, Combined therapy, Organotypic epithelial raft cultures, Merkel cell carcinoma, Merkel cell polyomavirus, CRISPR/Cas9
Disciplines:Morfologische wetenschappen, Oncologie, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project