TBA

Meer dan een derde van alle proteïnen gesynthetiseerd in het cytoplasma worden getransporteerd naar andere locaties. Dit secretie proces is essentieel and zorgt ervoor dat dit aanzienlijk aantal proteïnen correct gelokaliseerd wordt in het membraan of na het membraan, uit het cytoplasma. Het alomtegenwoordige Sec systeem in de bacterie Escherichia coli is de focus van het onderzoek in ons laboratorium en wordt gebruikt om het secretie fenomeen gedetailleerd te onderzoeken.

Een centrale component van het Sec systeem is het proteïnetranslocatiekanaal (translocase) dat opgebouwd is rond het eiwit SecY. Verscheidene cellulaire factoren worden verondersteld deel te nemen in het gidsen van membraan- en gesecreteerde proteïnen naar het translocatiekanaal (targeting), zowel co- als post-translationeel. Alle gesecreteerde proteïnen en sommige membraanproteïnen die gebruik maken van het Sec systeem worden gesynthetiseerd als ‘preproteïnen’ met N-terminale signaalsequenties die afgeknipt worden na translocatie. Het overblijvende deel van de proteïne is de ‘mature regio’ dat later de finale, natieve proteïnestructuur zal worden. De signaalsequentie wordt historisch aanzien als het enige signaal verantwoordelijk voor de 'targeting' van preproteïnen naar het translocatiekanaal. Maar, recent heeft ons laboratorium aangetoond dat de mature regio zowel nodig als voldoende is voor een succesvol targeting-proces. De mature regio's zijn dikwiijls belangrijker voor targeting dan de signaalsequentie. De cruciale rol van de signaalsequenties is de allosterische activatie van het translocatiekanaal.

Het translocatiekanaal herkent honderden preproteïnen met hoge affiniteit maar zonder sequentie-homologie. Ruggengraten (backbones) of zijketens van preproteïnen zouden kunnen dienen als herkenningselementen. Recente ontdekkingen geven de voorkeur aan de laatste optie. Hoe dan ook, de moleculaire basis van dit herkenningsmechanisme via hydrofobe segmenten door het Sec translocatiekanaal en de beweging doorheen het kanaal, blijven onbekend. Daarom, in het kader van deze thesis streven we ernaar om:

a. de mechanische bewegingen van het translocatiekanaal die preproteïne translocatie drijven, te begrijpen

b. de afzonderlijke functies van signaalsequenties en mature regio’s in het coördineren van de Sec translocatiekanaal bewegingen te analyseren

c. het belang van de verscheidene targeting signalen in de mature regio als preproteïne ‘herkenningshendels’ tijdens het stapsgewijze ‘duwen’ van de preproteïne doorheen het translocatiekanaal te definiëren

De preproteïne beweging doorheen het Sec translocatiekanaal zal onderzocht worden met een multidisciplinaire aanpak: hydrodynamische en biofysische methoden zullen gecombineerd worden met ‘cross-linking’ massaspectrometrie en enzymologie. Meer specifiek, vier werkonderdelen zijn voorzien:

1. Bepalen of bewegingen van het ‘preprotein binding domain’ (PBD) van de translocase motor SecA belangrijk zijn voor ‘docking’ en secretie van preproteïnen. Dit zal gebeuren via SecA mutanten die Cys-Cys paren kunnen vormen zodat de PBD geblokkeerd is in een van de drie posities.

2. Een assay opstellen om PBD bewegingen te bestuderen via ‘single molecule fluorescence resonance energy transfer’ (smFRET), gebruik makende van dubbel-gelabelde SecA dubbel Cys derivaten. De assay zal dan gebruikt worden om te bepalen hoe verschillende stoffen de PBD bewegingen beïnvloeden en om deze bewegingen kinetisch te karakteriseren in functie van factoren die preproteïne translocatie en PBD conformatie beïnvloeden.

3. Een beeld schetsen van de preproteïne beweging doorheen het Sec translocatiekanaal via een combinatie van foto cross-linking van preproteïne en translocatiekanaal met massa spectrometrie. Hiervoor zullen ‘bulky’ aminozuren in een model preproteïne vervangen worden door UV foto-activeerbare ‘cross-linkable’ aminozuren en cross-linking met het translocatiekanaal zal gebeuren in vier opeenvolgende fasen van de translocatiereactie. Met nanoLC-MS/MS zullen dan opgezuiverde fragmenten van gevormde complexen gekarakteriseerd worden, om zo de translocase oppervlakken die interageren met de preproteïne te karakteriseren op residu-niveau resolutie.

4. Het functioneel belang voor secretie bepalen van de hydrofobe targeting signalen in de preproteïne sequentie. Daarbovenop zullen smFRET paren worden gemaakt zodanig dat de donor probe gekoppeld is aan Cys residuen op verschillende preproteïne posities en de acceptor probe is gekopped aan één Cys residu in de periplasmatische zijde van SecY. Deze FRET paren laten toe de fysieke afstand afgelegd door het preproteïne segment te meten, waardoor translocatie snelheden bepaald kunnen worden.