De rol van DOT1L in systeemclerose

Systeemsclerose is een ernstige bindweefselziekte met een hoge morbiditeit en mortaliteit. De ziekte wordt gekenmerkt door autoimmuniteit, bloedvatafwijkingen en fibrose of verbindweefseling van huid en inwendige organen. De complexe interacties tussen verschillende signaalwegen in de pathogenese zijn nog onvolledig begrepen. Twee signaalwegen die betrokken zijn in het fibroseproces zijn de activatie van de canonieke “Wingless-type” (Wnt) signaalweg, en een imbalans in de oxidatieve status wat tot meer oxidatieve stress in weefsels leidt. Daarenboven werden recent de pathogenetische rol en het therapeutische potentieel van epigenetische fenomenen zoals de post-translationele veranderingen aan histonen, meer en meer erkend en onderzocht. 

In dit doctoraatsonderzoek zochten we nieuwe modulatoren die fibrose kunnen beïnvloeden. Hiertoe onderzochten we twee moleculen waarvoor reeds een verband met de Wnt signaalweg en met oxidatieve stress is beschreven: “Disruptor of telomerase 1 like” (DOT1L) en “acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A” (ANP32A). Daarnaast ontwikkelden we veilige micro-computed tomography (µCT) scanprotocollen voor preklinische diermodellen zoals voor longfibrose in muizen.

In het eerste deel van de thesis onderzochten we de rol van DOT1L in huidfibroblasten. DOT1L methyleert histon 3 op de Lysine 79 positie en beïnvloedt hierdoor genexpressie. Uit abdominale huid geïsoleerde primaire menselijke huidfibroblasten werden gekweekt met toevoeging van een specifieke inhibitor van DOT1L, EPZ-5676.  We bevestigden een interactie tussen DOT1L en de Wnt signaalweg; in deze fibroblasten was er verhoogde expressie van doelgenen van de Wnt signaalweg na DOT1L inhibitie. Daarnaast voerden we een analyse op basis van RNA sequencing uit op deze huidfibroblasten met en zonder toevoeging van de DOT1L inhibitor. Uit deze dataset konden we afleiden dat er meer genen een toe- dan afname in expressie vertoonden na inhibitie van DOT1L, met verhoogde expressie van specifieke basale membraan moleculen zoals Col15A1. De PIK3K-signaalweg, die al werd beschreven een rol te spelen in fibrose, was 1 van de signaalwegen die door inhibitie van DOT1L beïnvloed werd.

In een in vivo model van bleomycine geïnduceerde huidfibrose, konden we geen verschil aantonen in het ontstaan van huidfibrose in muizen met een fibroblast-specifieke deletie van DOT1L. De efficaciteit van de deletie konden we echter niet bevestigen in dit model.

In het tweede deel van de thesis exploreerden we de rol van ANP32A in fibrose, door het induceren van huidontsteking en -fibrose in muizen met ANP32A-deficiëntie. ANP32A is een klein eiwit met verschillende fysiologische functies. Het beschermt tegen oxidatieve stress in weefsels zoals kraakbeen, bot en hersenen, door transcriptionele controle van het “ataxia-telangiectasia mutated” (ATM) gen. Daarom zou het een rol kunnen spelen in fibrotische ziekten zoals systeemsclerose waarbij ook de imbalans in oxidatieve stress beschreven is. Daarnaast wordt ANP32A ook gelinkt met de Wnt signaalweg. ANP32A-deficiënte muizen bleken beschermd te zijn tegen subcutaan geïnjecteerd bleomycine geïnduceerde longfibrose en tegen het gewichtsverlies dat muizen hierdoor ontwikkelen.  Er was wel geen verschil in het ontstaan van huidfibrose in deze muizen.  ANP32A-deficiënte muizen waren ook niet beschermd tegen huidontsteking geïnduceerd door topisch aangebracht imiquimod, een TLR7 and TLR8 agonist.

Verlies van ANP32A was niet geassocieerd met een verlaagde ATM genexpressie of verhoogde oxidatieve stress in de huid, wat contrasteert met vorige observaties in de andere weefsels zoals kraakbeen en bot. Het enzyme bleomycine hydrolase, dat bleomycine inactiveert, was niet veranderd in de ANP32A-deficiënte longen. De dermis of lederhuid van mannelijke ANP32A-deficiënte muizen was minder dik en bevatte minder collagen, terwijl het bovenste deel van deze dermis meer cellen bevatte.  

We kunnen besluiten dat ANP32A deficiëntie tegen subcutaan bleomycine geïnduceerde longfibrose en gewichtsverlies beschermt. De onderliggende mechanismen hiervan moeten nog ontrafeld worden met verder onderzoek.

Als laatste deel van deze thesis ontwikkelden we veilige protocollen voor longitudinale in vivo micro-computed tomography (mCT) scans van muismodellen zoals bleomycine geïnduceerde longfibrose. Opeenvolgend scannen van muizen heeft het grote voordeel nauwkeurige kwantificatie van longbetrokkenheid en follow-up van therapie-effecten mogelijk te maken, terwijl er minder dieren nodig zijn per experiment. Gezien er vragen rezen over de invloed van herhaalde bestraling door het scannen op de dier/ziektemodellen zelf, onderzochten we de effecten van de bestraling op de ziekteuitkomst en op de zeer bestralingsgevoelige bloedcellen van longitudinaal gescande muizen in verschillende ziektemodellen en in gezonde muizen. We ontwikkelden een aangepast mCT protocol om veilig longitudinaal muismodellen te scannen. 

Dus in deze thesis onderzochten we  (1) de rol van DOT1L in huidfibroblasten, waarbij we DOT1L inhibitie linken aan de  PI3K-AKT signaalweg en veranderingen in basale membraan moleculen; (2) ontdekten we dat afwezigheid van ANP32A beschermt tegen subcutaan bleomycine geïnduceerde longfibrose, een belangrijk startpunt voor verder onderzoek in fibrose, en tenslotte (3) long beeldvorming van fibrose in muismodellen met de ontwikkeling van veilige mCT scanning protocollen.