Inzichten in de reactiewegen betrokken bij de verslaving van kanker B-cellen aan Bcl-2 ter hoogte van het endoplasmatisch reticulum

Het Bcl-2-eiwit functioneert als een negatieve regulator van geprogrammeerde celdood of apoptose en is bijgevolg opgereguleerd in veel kwaadaardige aandoeningen, waaronder B-celkankers zoals diffuus grootcellige B-cellymfomen (DLBCL) en chronische lymfatische leukemie (CLL). Bcl-2 inhibeert Ca2+-gemedieerde apoptotische celdood door toxische, proapoptotische Ca2+-vrijstelling uit het endoplasmatisch reticulum (ER), de voornaamste intracellulaire Ca2+-opslagplaats, te onderdrukken. Dit wordt verwezenlijkt door inhibitie van de inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP3) receptor (IP3R), een Ca2+-kanaal gelokaliseerd in de ER membraan dat Ca2+ vrijzet na stimulatie door zijn ligand IP3. Een celpermeabel peptide, BIRD-2, werd ontwikkeld als behandeling van kankercellen die afhankelijk zijn van ER-gelokaliseerd Bcl-2 voor de onderdrukking van toxische, IP3R-gemedieerde Ca2+-signalen. BIRD-2 functioneert als een competitieve inhibitor van de interactie tussen Bcl-2 en het IP3R-kanaal, waardoor de Bcl-2-gemedieerde onderdrukking van de IP3R opgeheven wordt. Bijgevolg doodt BIRD-2 Bcl-2-afhankelijke kankercellen, inclusief DLBCL en CLL, door het opwekken van spontane, proapoptotische Ca2+-signalen. Bovendien hebben we aangetoond dat de gevoeligheid van DLBCL cellen aan BIRD-2 correleert met het expressieniveau van IP3R2, de IP3R-isovorm met de hoogste gevoeligheid voor IP3. DLBCL cellen met een hoog expressieniveau van IP3R2 zijn dus zeer gevoelig aan BIRD-2, terwijl DLBCL cellen met een lage IP3R2-expressie eerder resistent zijn tegen het peptide. Hoewel deze recente studies belangrijke inzichten verschaften over hoe BIRD-2 Bcl-2-afhankelijke kankercellen doodt, spreekt het voor zich dat andere biologische pathways bijdragen tot de gevoeligheid van tumorcellen aan de Bcl-2-antagonist. Daarom is de algemene doelstelling van dit project het identificeren van additionele biologische mechanismen die aan de grondslag liggen van de afhankelijkheid van bepaalde kankertypes aan de pro-survival functie van Bcl-2 ter hoogte van het ER. Kortom, we hebben de bijdrage van constitutieve IP3-signalen, store-operated Ca2+ entry (SOCE), en hyperactieve proteïne kinase B (PKB)/Akt-signalering aan BIRD-2-geïnduceerde celdood onderzocht.

Ten eerste hebben we aangetoond dat constitutieve IP3-signalen, die downstream van de B-celreceptor voorkomen, essentieel zijn voor de overleving van B-kankercellen. Farmacologische inhibitie van fosfolipase C (PLC), dat de productie van IP3 katalyseert, veroorzaakte namelijk celdood in B-kankercellen. Milde PLC inhibitie beschermde echter tegen BIRD-2-geïnduceerde apoptose in DLBCL en CLL. Dit wijst erop dat pro-surival IP3-signalen omgevormd worden tot dodelijke signalen door het verbreken van Bcl-2’s inhibitie op de IP3R met BIRD-2. Deze resultaten geven aan dat naast hoge expressieniveaus van IP3R2 ook constitutieve IP3-signalen bepalend zijn voor de verslaving van kankercellen aan Bcl-2 ter hoogte van de ER Ca2+-opslagplaatsen.

Vervolgens hebben we aangetoond dat BIRD-2-geïnduceerde apoptose afhankelijk is van zowel Ca2+ aanwezig in het ER als extracellulaire Ca2+, maar niet van SOCE, in DLBCL kankercellen. Vermits BIRD-2 apoptotische celdood uitlokt door excessieve vrijstelling van Ca2+ uit het ER, veronderstelden we dat behandeling met BIRD-2 leidt tot activatie van SOCE, een belangrijke Ca2+-influx pathway die geactiveerd wordt na depletie van de ER Ca2+-opslagplaats. SOCE inhibitie had echter geen invloed op de Ca2+-respons, noch op celdood uitgelokt door BIRD-2 in DLBCL cellen, wat erop wijst dat SOCE niet geactiveerd wordt door BIRD-2-behandeling en dat SOCE niet bijdraagt tot de BIRD-2-geïnduceerde celdoodrespons. Daarentegen werden de toxische effecten van BIRD-2 wel gereduceerd door chelatie van Ca2+ aanwezig in de extracellulaire omgeving, wat erop duidt dat extracellulaire Ca2+ een belangrijke rol speelt in BIRD-2-geïnduceerde celdood. Daarnaast werd de celdoodrespons van BIRD-2 ook verminderd door depletie van de ER Ca2+-opslagplaats. Deze resulaten tonen aan dat zowel de inhoud van de ER Ca2+-opslagplaats als Ca2+ aanwezig in de extracellulaire omgeving kritische determinanten zijn van BIRD-2-uitgelokte apoptotische celdood, terwijl SOCE niet geactiveerd wordt door de Bcl-2-antagonist.

Ten slotte hebben we onderzocht of hyperactive PKB/Akt-signalering de gevoeligheid van kankercellen aan BIRD-2 doet afnemen. PKB/Akt onderdrukt proapoptotische Ca2+-signalen ter hoogte van het ER door de activiteit van IP3R3 te moduleren. Op deze manier kan hyperactive PKB/Akt-signalering, geobserveerd in DLBCL kankercellen, de gevoeligheid aan BIRD-2 van DLBCL cellen met hoge IP3R3-expressieniveaus verlagen. Onze resultaten tonen aan dat BIRD-2-geïnduceerde celdood toeneemt door inhibitie van PKB/Akt-signalering in DLBCL. Dit blijkt echter geen gevolg te zijn van de effecten van PKB/Akt op IP3R3-gemedieerde Ca2+-vrijgave uit het ER, vermits de IP3-geïnduceerde Ca2+-vrijzetting en de BIRD-2-uitgelokte Ca2+-respons niet toenamen na inhibitie van PKB/Akt. Daarentegen tonen we aan dat PKB/Akt-inhibitie de balans tussen pro- en antiapoptotische Bcl-2-familieleden verstoort, aangezien het blokkeren van PKB/Akt-signalering de expressieniveaus van antiapoptotisch Mcl-1 verminderde terwijl de expressie van het proapoptotische Bim proteïne toenam. De potentiatie van BIRD-2-uitgelokte celdood na inhibitie van PKB/Akt-signalering in DLBCL is dus vermoedelijk het resultaat van veranderde expressieniveaus van de Bcl-2-familieleden.

Kortom, door de studie van pathways die bijdragen tot BIRD-2-geïnduceerde celdood in kankercellen die afhankelijk zijn van de pro-survival functie van Bcl-2 ter hoogte van het ER verkregen we nieuwe inzichten in hoe intracellulaire Ca2+-dynamieken apoptotische celdoodprocessen in biologische systemen sturen. Deze bevindingen zullen mogelijk bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe celdoodtherapieën voor de behandeling van Bcl-2-afhankelijke tumoren.