Onderzoek naar de NEAT1-paraspeckles pathway als een mogelijk therapeutisch doelwit voor op RNA-gebaseerde behandeling van kanker.

NEAT1 is een abundant nucleair RNA dat sterk geconserveerd is doorheen de evolutie van zoogdieren, en dat niet codeert voor eiwitten. Van het NEAT1 locus in het DNA worden twee isovormen afgeschreven, NEAT1_1 (3.7 kb) en een langere NEAT1_2 (22.7 kb). Deze laatste is het zgn. ‘geraamte’, of de architecturale hoofdcomponent van een membraanloos deeltje in de celkern, de paraspeckle.

In deze thesis tonen we aan dat het tumor-onderdrukkend eiwit p53 de transcriptie van NEAT1 induceert, wat leidt tot de vorming van paraspeckles in cellen in weefselkweek, in de huid van de muis en in menselijke tumoren van epitheliale origine. We gebruikten een muismodel van chemisch-geinduceerde huidkanker samen met de genetische knock-out van Neat1 om aan te tonen dat dit lang, niet-coderend RNA bijdraagt tot het ontstaan van tumoren. Vervolgens toonden we aan met in vitro studies dat het verlies van NEAT1 door middel van knockdown kankercellen gevoeliger maakt aan courante chemotherapeutische medicijnen zoals doxorubicine en de PARP-inhibitor ABT-888. Knockdown zonder externe toevoeging van stress veroorzaakt bovendien reeds een accumulatie van schade aan het DNA. De knockdown van de lange isovorm NEAT1_2, de centrale bouwsteen van de paraspeckle, is voldoende om deze fenotypes te veroorzaken. Dit suggereert dat de paraspeckles de functionele eenheden zijn in dit proces. Knockdown van NEAT1 voorkomt een juiste activatie van de ATR-Chk1 pathway wat het vereiste DNA-herstel vertraagt. Deze verlaagde signalisatie kan mogelijks leiden tot een verhoging in gebroken replicatie-vorken in het DNA, wat ervoor zorgt dat de cellen stoppen met delen in de volgende G1 fase. Ten slotte kunnen hogere expressieniveaus van de lange isovorm in een cohort van cisplatinum-behandelde eierstokkanker-patienten een zwakkere overlevingskans voorspellen, daar wanneer beide isovormen in acht worden genomen is er geen voorspellende waarde voor de patient.

Het feit dat deze observaties isovorm-specifiek zijn (bv. knockdown van de lange isovorm alleen was genoeg om een groeifenotype te induceren) gaf ons een goede reden om de individuele bijdrage van elke isovorm te onderzoeken in het tweede deel van dit werk. We vonden dat, ondanks een gezamenlijke regulatie door p53 op promoter-niveau, beide isovormen op een verschillende manier tot expressie komen bij verschillende vormen van stress. Dit proces wordt gemedieerd door alternatieve processsing van het 3’ einde van de korte isovorm NEAT1_1. Nutlin-3a activeert p53 farmacologisch en stopt de cellen in de G1 fase van de celcyclus. Behandeling met Nutlin-3a leidt tot grote hoeveelheiden NEAT1_1 detecteerbaar buiten de paraspeckles. Hiermee in contrast stopt hydroxyurea de cellen in het midden van de S-fase bovenop de activatie van p53. Wanneer we de cellen met deze stof behandelen konden we NEAT1_1 niet meer buiten de nucleaire deeltjes vinden in de meerderheid van de cellen. In een niet-behandelde gemengde populatie varieert de proportie van NEAT1_1-tot expressie brengende cellen buiten de paraspeckles sterk. Deze observatie suggereert dat de NEAT1 isovorm configuraties in de cel celcyclus afhankelijk kunnen zijn.

We vonden vervolgens dat NEAT1_1 de voornaamste isovorm is in rustende (G0) en G1 cellen, en dat deze isovorm verdwijnt vanaf de S-fase (DNA-replicatie). Bovendien vonden we dat de korte isovorm uit de cel gehaald kon worden zonder de lange vorm aan te tasten door middel van een deletie van het polyadenylatiesignaal met behulp van het CRISPR-systeem. Deze cellen, in dewelke de korte vorm niet tot expressie komt, groeien normaal en vormen normale paraspeckles. Knockdown van de lange vorm in deze cellen zorgt nog steeds voor een groeiarrest wat impliceert dat de lange vorm functioneel blijft wanneer de korte niet aanwezig is.

In feite suggereert de data hier dat een lang aanvaard paradigma in paraspeckle onderzoek niet correct zou kunnen zijn: uit ons werk blijkt immers dat NEAT1_1 niet bijdraagt tot paraspeckle-functie of vorming en dat de hypothese dat NEAT1_1 wordt gerekruteerd in de paraspeckles fout zou kunnen zijn. Inderdaad, bovenop onze schatting dat NEAT1_1 expressie bijna nul is in condities in dewelke enkel NEAT1_2 wordt geobserveerd, vonden we ook een mechanisme van NEAT1_1 degradatie door het RNA exosoom. Hier zijn verdere studies noodzakelijk om een celcyclus-specifieke rol van het RNA exosoom-gemedieerde degradatieproces vast te stellen.

Ten slotte herhaalden we ons korte termijn huidcarcinogenese-experiment met muizen die enkel Neat1_1 ontbreken. Dit experiment toonde aan dat Neat1_2 competente cellen (WT en knockout voor Neat1_1) zich gedragen op een gelijkaardige manier, in tegenstelling tot muizen die Neat1_2- en paraspeckle-incompetent zijn, en die een verlaging tonen in epidermale hyperplasie en een verhoging in DNA-schade zoals aangetoond in het eerste deel van dit werk. Op een gelijkaardige manier kunnen de fenotypes beschreven door ons lab en anderen die de borstklier en andere aspecten van de vruchtbaarheid van de muis beinvloeden niet teruggevonden worden in muizen die enkel de korte vorm ontbreken, wat aantoont dat het effectief de lange vorm is die een groei- en overlevingsvoordeel geeft wanneer cellen moeten weerstaan aan interne en externe stressors.

Samengevat, het werk gepresenteerd in deze thesis toonde aan dat kankercellen de beschermende functie van NEAT1_2/paraspeckles kapen, maar dat de meer abundante en beter geconserveerde NEAT1_1 isovorm niet blijkt bij te dragen aan dit proces. Dus, alhoewel NEAT1 een populair studieobject is, blijven vele aspecten van NEAT1 en paraspeckle biologie nog steeds een mysterie.