Identificatie en toepassing van biofilm-specifieke, niet-biocidale inhibitoren in de brouwerijsector.

Micro-organismen komen voornamelijk voor in dense, oppervlakte-geassocieerde gemeenschappen, die biofilmen worden genoemd. De meeste natuurlijke biofilmen bevatten bovendien verschillende species, die met elkaar kunnen interageren en daardoor elkaar beïnvloeden. Eén van de belangrijkste eigenschappen van multispecies biofilmen is dat ze meer tolerant zijn tegen antimicrobiële middelen. Hierdoor veroorzaken multispecies biofilmen nog steeds aanzienlijke problemen in industriële omgevingen. Een betere kennis over het ontstaan van de verhoogde tolerantie in deze biofilmen kan bijdragen tot het ontwikkelen van nieuwe anti-biofilm strategieën. Het doel van dit doctoraatsonderzoek is daarom het karakteriseren van de ecologische en evolutionaire processen die verantwoordelijk zijn voor de verhoogde tolerantie. Om de industriële toepasbaarheid van onze resultaten te verhogen werd in dit onderzoek gebruik gemaakt van multispecies biofilm modellen, die gebaseerd zijn op biofilmen uit de brouwerij-omgeving.

In een eerste stap werd de microbiële contaminatie in brouwerijen onderzocht door biofilm stalen te analyseren die werden verzameld uit drie brouwerijen in België. Onze resultaten toonden aan dat de huidige desinfectiemethodes niet volstaan om de microbiële contaminatie te verwijderen. Daarnaast identificeerden we verschillende species die in meerdere stalen voorkwamen en ook werden teruggevonden in biofilm stalen in eerder onderzoek. Op basis van deze stalen werden vervolgens twee soorten biofilm modellen opgesteld, die verder in dit onderzoek zullen worden gebruikt. Ongedefinieerde modellen werden opgegroeid vanaf de volledige biofilm stalen en de exacte species samenstelling was bijgevolg niet gekend. Gedefinieerde biofilm modellen werden daarentegen opgegroeid door een vast aantal species te combineren, die uit hetzelfde staal werden geïsoleerd. Vervolgens werd een screening van gekende monospecies biofilm inhibitoren uitgevoerd om componenten te identificeren die actief zijn tegen multispecies brouwerij biofilmen. Hierbij werd gebruik gemaakt van de ongedefinieerde modellen en sulfathiazol werd geïdentificeerd als de meest breed-spectrum inhibitor.

In een volgende stap werden de eigenschappen van de multispecies biofilmen verder geanalyseerd door de inter-species interacties in 12 gedefinieerde modellen te onderzoeken. Gebaseerd op het verschil in groei van elk species in mono- en multicultuur, werden interacties geclassificeerd als competitief of coöperatief. In overeenstemming met eerdere studies werden voornamelijk competitieve interacties teruggevonden. Vervolgens werd de antimicrobiële tolerantie van de multispecies biofilmen onderzocht door sulfathiazol toe te voegen aan drie gedefinieerde modellen. In alle modellen verhoogde de tolerantie in de multispecies biofilm, in vergelijking met de monospecies biofilmen. In twee van de modellen kon de verhoogde tolerantie verklaard worden door een vermindering van competitieve interacties. Sterke competitors in deze modellen waren meer gevoelig aan sulfathiazol dan de onderdrukte species en daardoor zorgde een verminderde groei van de sterke competitors voor een heropleving van de onderdrukte species. Deze species ondervonden bij gevolg een lagere percentuele inhibitie en er ontstond een algemene verhoogde tolerantie in de multispecies biofilm. In het laatste model, dat bestond uit een duo-species biofilm met Pseudomonas en Raoultella, kon de verhoogde tolerantie van Pseudomonas niet volledig worden verklaard door een verminderde competitie. In dit geval verhoogde de aanwezigheid van een concurrerend species rechtstreeks de inherente tolerantie van Pseudomonas.

In een laatste deel van dit onderzoek werd de verhoogde tolerantie van Pseudomonas in het hierboven vermelde duo-species biofilm model verder gekarakteriseerd. Deze tolerantie was niet afhankelijk van de fysieke aanwezigheid van Raoultella en werd waarschijnlijk veroorzaakt door een gesecreteerd product. Daarnaast werd de ontwikkeling van resistentie in de duo-species biofilm opgevolgd in een evolutie experiment van 80 dagen. De groei van Pseudomonas nam toe in de duo-species biofilm, maar in monocultuur kon dit species geen resistentie tegen sulfathiazol ontwikkelen. Bovendien verwierven Pseudomonas species, die 36 dagen evolueerden in de behandelde duo-species biofilm, een resistentie die niet meer afhankelijk was van de aanwezigheid van Raoultella.

Samenvattend werden in dit onderzoek een aantal belangrijke nieuwe inzichten in de verhoogde tolerantie in multispecies biofilm verworven. Ten eerste toonden we aan dat veelvoorkomende competitieve interacties aan de basis liggen van de vaak gerapporteerde verhoogde tolerantie in multispecies biofilmen. Ten tweede vonden we dat de aanwezigheid van concurrerende species de inherente tolerantie van micro-organismen ook rechtstreeks kan verhogen. Tot slot observeerden we dat een initieel kleine verhoging in tolerantie van een species, veroorzaakt door de aanwezigheid van andere species, aanleiding kan geven tot de evolutie van een volledig resistent species.