Moleculaire sequentie-analyse voor het bepalen van de variabiliteit van tandemherhalingen en hun epigenetische profiel in het humane genoom.

Er bevinden zich ongeveer 1,5 miljoen korte tandemherhalingen (bv. CGGCGGCGG) verspreid over het hele humane genoom: van exonen en intronen tot promotors, transcriptiefactoren en zelfs regio’s zonder coderende functie. Deze korte tandemherhalingen zijn functionele elementen die een impact hebben op het fenotype van een individu. Hun aanwezigheid heeft immers effect op de biologie van een cel doordat ze het genoom, het transcriptoom en het proteoom kunnen beïnvloeden. Dat tandemherhalingen functionele elementen zijn, komt het meest duidelijk tot uiting in de verschillende ziektes die veroorzaakt worden door grote expansies van deze herhalingen. Vandaag de dag zijn er meer dan 40 van deze ziektes gekend waaronder het fragiele-X syndroom (FXS) en myotone dystrofie type 1 (DM1).

Vele aspecten van deze korte tandemherhalingen zijn tot nu toe onduidelijk doordat ze in het verleden niet voldoende bestudeerd werden. Dit heeft twee belangrijke redenen: enerzijds onderschatten wetenschappers vaak de impact die deze elementen kunnen hebben, anderzijds worstelen de meeste technologieën tot nu toe met hun repetitieve karakter. Dankzij de komst van een nieuwe technologie, ‘Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing’ ontwikkeld door Pacific Biosciences, kunnen deze tandemherhalingen meer gedetailleerd geanalyseerd worden.

In deze doctoraatsthesis wordt gebruik gemaakt van verschillende voordelen van SMRT sequencing om verschillende aspecten van tandemherhalingen te bestuderen. Twee voordelen van SMRT sequencing zijn ten eerste, de lange leeslengte die toelaat om grote, GC-rijke tandemherhalingen te overspannen en ten tweede, de detectie van epigenetische modificaties. Een nadeel is echter het beperkt aantal moleculen dat per experiment kan gelezen worden. Hierdoor is het financieel onhaalbaar om een volledig humaan genoom te sequeneren als men slechts geïnteresseerd is in één bepaalde regio. Daarom worden er vaak aanrijkingsmethoden zoals PCR gebruikt om één bepaalde regio te amplificeren. Voor deze studie is dit echter niet interessant aangezien PCR erg onnauwkeurig is wanneer het een tandemherhaling moet amplificeren. Bovendien verwijdert het alle epigenetische markeringen. Mét PCR is een volledige genetische en epigenetische karakterisering van tandemherhalingen dus onmogelijk. Daarom ontwikkelden we in dit onderzoek een aanrijkingsmethode zonder amplificatie waarbij de moleculaire schaar CRISPR/CAS9 werd gebruikt om de FMR1 CGG herhaling uit het genoom te knippen. Door het toevoegen van restrictie-enzymen, konden off-target genomische DNA fragmenten weggeknipt worden. Door deze amplificatie-vrije aanrijkingsmethode toe te passen op BAC DNA kon de variabiliteit van de FMR1 CGG herhaling en de epigenetische modificaties accuraat bepaald worden. Doordat met deze methode het originele DNA molecule wordt afgelezen, kan niet alleen de originele, biologische variabiliteit van tandemherhalingen bepaald worden, maar kan ook om de aanwezigheid van DNA modificaties gedetecteerd worden. In humaan DNA kon een aanrijking van meer dan 100X bekomen worden, waarbij in één SMRT cel tot 5 reads de FMR1 CGG herhaling bevatten. Deze methode heeft het potentieel om complexe genotype-fenotype correlaties in FXS te verbeteren, mits het aantal reads met de FMR1 CGG herhaling verder verhoogd kan worden in de toekomst.

Daarnaast zou deze amplificatie-vrije aanrijking van de FMR1 CGG herhaling in de toekomst ook in fragiele-X diagnostiek geïmplementeerd kunnen worden om lange, gemethyleerde CGG allelen op te sporen. Het kan daarbij Southern blot vervangen, een arbeidsintensieve en inaccurate methode die vandaag in gebruik is.

FXS, de meest voorkomende erfelijke vorm van een X-gebonden verstandelijke beperking, ontstaat nadat een premutatie (55-200 CGG herhalingen) expandeert tot een volledige mutatie (>200 CGG herhalingen). Het risico dat een premutatie overgaat in een volledige mutatie hangt af van de grootte van de premutatie en het aantal AGG eenheden die de CGG herhalingen onderbreken (CGGCGGCGGAGGCGGCGG). Het is daarom belangrijk om deze AGG eenheden in kaart te brengen wanneer men de stabiliteit van het FMR1 CGG allel wil bestuderen. Daarnaast is een eenvoudige toegang tot accurate AGG informatie ook belangrijk in genetische counseling, waar de informatie samen met de grootte van de tandemherhaling gebruikt wordt om het risico dat een premutatie expandeert te bepalen. Deze risicoanalyse kan dan gebruikt worden door vrouwen met een premutatie om de kans in te schatten dat ze een kind met FXS. De detectie van deze AGG’s is echter zeer moeilijk met de huidige technieken. Daarom werd in dit onderzoek aangetoond dat SMRT sequencing kan gebruikt worden om AGG eenheden te detecteren in zowel mannelijke als vrouwelijke stalen. Deze methode is uniek aangezien het de enige methode is die het normale allel van het premutatie allel kan scheiden en vervolgens de structuur kan bepalen in beide allelen. Daarom werd SMRT sequencing na de ontwikkeling en validatie geïmplementeerd als een diagnostische test voor vrouwen met een FMR1 premutatie. Hierdoor konden we de risicoanalyse verfijnen wat de genetische counseling van vrouwen met een premutatie kon verbeteren. Daarnaast werd deze methode ook gebruikt in een kleinschalige studie waarbij de invloed van AGG onderbrekingen op de stabiliteit van intermediaire FMR1 allelen (45-54 CGG eenheden) werd bestudeerd.

SMRT sequencing werd ook gebruikt om de DMPK CTG herhaling geassocieerd met DM1 te bestuderen. Ten eerste werd de variabiliteit van de herhaling bepaald door small-pool PCR te combineren met SMRT sequencing. Met behulp van deze methode kon de variabiliteit van de CTG herhaling sneller en met een hogere accuraatheid geanalyseerd worden, in vergelijking met Southern blots. Daarom wordt dit nu toegepast om de invloed van DNA-herstelmechanismen op de variabiliteit van de CTG herhaling te bestuderen. Daarnaast werd SMRT sequencing ook ingezet om de efficiëntie van het uitknippen van de DMPK CTG herhaling door CRISPR/CAS9 te bepalen. Doordat hiervoor een sequeneringsmethode gebruikt werd, kon de invloed van CRISPR/CAS9 tot op nucleotide niveau bepaald worden. Dit is de eerste studie waarbij SMRT sequencing toegepast werd voor de studie van de DMPK CTG herhaling. Deze analyse zou in de toekomst nog verder verbeterd kunnen worden als er ook voor deze herhaling een amplificatie-vrije aanrijkingsmethode zou ontwikkeld worden.

Uit deze studie kunnen we concluderen dat SMRT sequencing een krachtig instrument is dat de studie en diagnostiek van tandemherhalingen verbetert. Nieuwe methodologieën werden ontwikkeld om de voordelen van deze technologie maximaal te gebruiken (lange ‘reads’, een hoge accuraatheid en de detectie van DNA modificaties). Het is erg interessant om op te volgen hoe nieuwe methodes, zowel ontwikkeld in deze thesis als door andere onderzoeksgroepen, zullen gebruikt worden om onze kennis over tandemherhalingen verder te vergroten in de toekomst.