Studie van moleculaire doelwitten voor de inhibitie van alphavirus en enterovirus replicatie

Chikungunya virus (CHIKV) is een door muggen overgebracht virus dat behoort tot het genus alphavirus van de Togaviridae familie. De symptomen van een acute infectie met CHIKV zijn koorts en gewrichtspijn. Deze gewrichstpijnen kunnen in sommige patiënten uitgroeien tot een blijvende, invaliderende polyartritis die weken en zelfs jaren na de acute fase kan aanhouden. Ondanks het wereldwijd voorkomen van CHIKV infecties en de hoge morbiditeit die ermee verbonden is, is er geen goedgekeurd vaccin of behandeling met antivirale middelen beschikbaar op dit moment. Daarom is de ontwikkeling van krachtige antivirale middelen tegen CHIKV dringend nodig.

Hebben we aangetoond dat prostratin, een krachtige activator van proteïne kinase C (PKC), CHIKV RNA en virus partikels vermindert op een dosis-afhankelijke manier tijdens een post-entry stap van de virale levenscyclus. Het antivirale effect van prostratin was celtype-afhankelijk. Krachtige antivirale activiteit werd waargenomen in humane fibroblasten van de huid, de eerste cellen die door CHIKV geïnfecteerd worden na een muggenbeet. De antivirale activiteit van prostratin werd duidelijk verminderd in de aanwezigheid van PKC remmers, hetgeen bevestigt dat het antivirale effect resulteert uit de activatie van PKC en dat PKC's potentiële doelwitten zijn voor de remming van CHIKV replicatie.

In dezelfde context hebben we salicylaat-analogen van bryostatine, een andere PKC activator, geïdentificeerd die cellen beschermen tegen CHIKV geïnduceerde celdood. Interessant genoeg blijkt dat de 'capping' van een hydroxylgroep van een bryostatine analoog, die cruciaal is voor het binden aan PKC, geen invloed heeft op de anti-CHIKV activiteit van het molecule, wat doet vermoeden dat er een PKC-onafhankelijk mechanisme meespeelt. Werd daarom een gedetailleerde vergelijkende analyse uitgevoerd van het effect van de ‘uncapped’ versus twee ‘capped’ bryostatine analogen. Hieruit bleek dat de ‘uncapped’ bryostatine analogen zowel vroege als late stadia van de CHIKV replicatiecyclus verhinderen terwijl de ‘capped’ analogen enkel de latere fases verhinderen. Gelijktijdige toediening van PKC remmers verminderde de antivirale activiteit van de ‘uncapped’ analogen, maar er was geen effect op het anti-CHIKV effect van de ‘capped’ analogen. Aldus kunnen de ‘capped’ bryostatine analogen CHIKV replicatie remmen door een nieuwe, op dit moment nog niet opgehelderde, PKC onafhankelijke route. De behandeling van CHIKV geïnfecteerde cellen met een combinatie van een ‘uncapped’ en een ‘capped’ analoog resulteerde in een uitgesproken synergistisch antiviraal effect.

Favipiravir (T-705) is een breed-spectrum antiviraal middel met een sterk remmend effect op CHIKV replicatie in celkweek. Evalueerden we het mogelijke beschermende effect van favipiravir tegen CHIKV replicatie, zowel tijdens de acute als de chronische fase van de CHIKV infectie in een muismodel. Favipiravir behandeling tijdens de acute fase van de infectie was in staat om de systemische virale verspreiding volledig te remmen en verminderde het virale RNA in de enkels van de met virus geïnoculeerde pootjes. Anderzijds heeft de favipiravir behandeling tijdens een latere fase van de infectie geen significant effect op het virale RNA in de enkels. cDNA amplificatie van het CHIKV coderingsgebied van het virale RNA van zowel de acute als chronische fase toonde dat het virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) amplicon ontbreekt en dat de genen van sommige virale eiwitten een kleiner formaat hebben dan verwacht. Dit leverde een eerste indicatie dat het virale RNA gedetecteerd tijdens de chronische fase een defect viraal genoom of afgebroken RNA is en niet het genoom van actief replicerend virus.

Eerder onderzoek in ons laboratorium toonde aan dat de K291R substitutie in het CHIKV RdRp betrokken is bij resistentie tegen favipiravir in vitro. Interessant is dat dit lysine een sterk geconserveerd aminozuur is in het RdRp van positieve, enkelstrengige RNA [+ ssRNA] virussen. Om inzicht te krijgen in de unieke breed-spectrum antivirale activiteit van favipiravir, onderzochten we de rol van dit lysine met behulp van het coxsackievirus B3 (CVB3). Introductie van de overeenkomstige K-naar-R substitutie in het CVB3 RdRp (K159R) resulteerde in een niet-levensvatbaar virus. Replicatie competentie werd hersteld na een spontane verwerving van de A239G substitutie in het RdRp. Een mutagenese-analyse op positie K159 resulteerde in slechts één extra levensvatbare CVB3 variant (K159M), die ook de A239G mutatie bleek te hebben verworven. De K159 mutaties verminderden duidelijk de RdRp efficiëntie in in vitro polymerase testen. De RdRp efficiëntie kon worden hersteld door de introductie van de A239G mutatie. De K159R-A239G en K159M-A239G virussen waren meer vatbaar voor favipiravir dan wild-type virus (WT) en vertoonden een lagere fideliteit in polymerase testen. Bovendien vertoonde de K159R-A239G-variant een sterk afgezwakt fenotype in muizen. Deze resultaten bevestigen dus dat dit geconserveerde lysine van het virale RdRp een belangrijk residu is voor zowel de functionaliteit van dit enzyme als voor het breed-spectrum werkingsmechanisme van favipiravir.

Naast CHIKV hebben vele andere virussen ook een gebrek aan een beschikbare antivirale behandeling, waaronder enterovirussen (Picornaviridae familie). Hoewel infecties met enterovirussen meestal mild zijn, kunnen ze af en toe leiden tot ernstige symptomen zoals paralytische poliomyelitis door poliovirussen (PV) en myocarditis door CVBs. Identificeerden we een nieuwe en selectieve benzeen sulfonamidederivaat inhibitor (verbinding 17) van CVB3 replicatie die in silico ontworpen werd om het virale 3C protease te remmen. We toonden aan dat verbinding 17 de replicatie remt van een panel van groep B enterovirussen, maar geen antivirale activiteit heeft tegen representatieve virussen van andere enterovirus groepen. In tegenstelling tot wat voor een proteaseremmer werd verwacht, toonde een time-of-drug-additie studie aan dat verbinding 17 interfereert met een vroege stap in de virale levenscyclus. Deze waarneming werd bevestigd door de resultaten van een thermostabiliteitsstudie, hetgeen extra bewijs leverde van een interactie tussen het molecule en het virale capside. Vervolgens werd dit ook bevestigd door de genotypering van onafhankelijk geselecteerde CVB3 varianten resistent tegen molecule 17, die allemaal bleken een mutatie in het VP1 gen te dragen. Interessant is dat de gemuteerde VP1 residuen niet gelegen zijn binnen de klassieke-drug bindingsplaats voor capside binders zoals pleconaril. Anderzijds blijken zowel de VP1 glutathion bindingsplaats als het ionenkanaal van de 5-voudige as van het VP1 pentameer betrokken te zijn bij het werkingsmechanisme van dit molecule.

Tot slot toonden we aan dat glutathion (GSH), een essentiële gastheerfactor voor de stabilisatie van het enterovirus capside gedurende de morfogenese, een uitgesproken warmte-stabiliserend effect heeft voor de drie types van poliovirus (PV) Sabin vaccin-stammen. CVB3 werd gebruikt als een surrogaat voor PV om te beoordelen of het GSH-gestabiliseerde virus nog steeds infectieus is in een muismodel (een vereiste voor het levend verzwakt vaccin). Inderdaad, terwijl warmte-geïnactiveerd CVB3 niet meer infectieus was in SCID muizen, bleef het GSH-gestabiliseerde virus infectieus net zoals als het onverwarmde virus. Verschillende studies zijn momenteel gaande om genetisch stabiele Sabin poliovirussen te genereren om te gebruiken als een veilig, oraal, levend afgezwakt vaccin in het tijdperk na de polio uitroeiing. Aangezien GSH van nature aanwezig is in hoge concentraties in het menselijk lichaam, is dit een veilige en efficiënte kandidaat stabilisator voor deze nieuwe, orale poliomyelitis vaccin (OPV) formuleringen.