< Terug naar vorige pagina

Project

De moleculaire ontrafeling van drie antibacteriële proteïnen van Pseudomonas faag LUZ19 voor biotechnologische toepassingen

De studie van bacteriële virussen of ‘bacteriofagen’ is een interessant onderzoeksveld dat toepassingen kent in verschillende domeinen. Zo is de moderne moleculaire microbiologie gebaseerd op fundamenteel faagonderzoek en zijn faagafgeleide enzymen en kloneringstechnieken niet weg te denken uit moleculaire laboratoria. Daarnaast worden fagen in zowel medische, industriële, voedsel en agrarische omgevingen gebruikt om efficiënt bacteriën te bestrijden. Ook faagproteïnen en afgeleide producten kennen toepassingen voor de behandeling van bacteriële infecties. Daarom worden fagen aanzien als een goudmijn voor de ontwikkeling van nieuwe moleculaire middelen voor antimicrobiële en biotechnologische toepassingen, mede dankzij het feit dat ze de meest voorkomende en gediversifieerde entiteiten op aarde zijn.

Pseudomonas aeruginosa is een belangrijk, opportunistisch pathogeen dat ernstige infecties veroorzaakt in immunodeficiënte en gehospitaliseerde personen, zoals mensen met brandwonden en patiënten met mucoviscidose. De toenemende resistentie van deze bacterie tegen een brede waaier aan antibiotica maakt de bestrijding steeds moeilijker en stimuleert bijgevolg de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen. Eén van de strategieën in dit onderzoeksdomein is de studie van faagproteïnen die toxisch zijn voor hun gastheer. Deze proteïnen veroorzaken een groeistop of zelfs celdood van de gastheer, waardoor ze gedacht worden in te werken op essentiële, bacteriële processen tijdens faaginfectie om zo een gunstige omgeving te creëren voor de productie van nieuwe faagpartikels. Echter zijn de functies van deze proteïnen meestal niet gekend. Bovendien vertonen hun sequenties weinig of geen similariteit met sequenties van gekende proteïnen, waardoor sequentiegebaseerde functievoorspellingen niet mogelijk zijn. Daarom werden in dit onderzoek drie toxische proteïnen van faag LUZ19 in detail bestudeerd, in de hoop om nieuwe antibacteriële strategieën tegen P. aeruginosa te identificeren.

LUZ19 gp4, hernoemd tot ‘Qst’, bleek het P. aeruginosa-specifieke quorum sensingsysteem PQS te beïnvloeden, alsook enkele centrale pathways van het gastheermetabolisme. Dit werd aangetoond op zowel metaboloom- als interactoomniveau, waarbij Qst interageert met zowel enzymen van de biosynthesewegen van cofactoren (ThiD en CoaC, voor de aanmaak van respectievelijk cofactoren thiamine-pyrofosfaat en coenzyme A) als enzymen betrokken in de biosynthese van twee signaalmoleculen: i) het gekende quorum sensing molecule PQS (biosynthese-enzym PqsD) en ii) een voorspeld niet-ribosomaal peptide (biosynthese-enzym PA1217), waarbij het substraat of product van de enzymen significant veranderde in aanwezigheid van Qst in P. aeruginosa. De vier interactiepartners vertoonden bovendien onderlinge affiniteit, waardoor een volledig nieuw en complex interactienetwerk werd ontdekt, met als mogelijke link de cofactor coenzyme A. Er werd verder ingegaan op de invloed van Qst op cel-celcommunicatie, waarbij kon aangetoond worden dat PA1217 de antibacteriële activiteit van Qst inhibeert, de reductie in signaalmoleculen PQS werd bevestigd en PqsD essentieel bleek voor normale infectie door faag LUZ19. Hierdoor resulteerde dit onderzoek in een eerste identificatie van een faagproteïne dat inwerkt op quorum sensing voor efficiënte infectie.  

LUZ19 gp21 is een nucleïnezuur-bindend proteïne dat in de bacteriële cel aggregeert tot mobiele ‘foci’. Na een studie van mutante gp21-varianten die niet meer toxisch bleken te zijn, konden beide eigenschappen direct geassocieerd worden met de antibacteriële activiteit. De geobserveerde focivorming van gp21 vertoont gelijkenissen met gerapporteerde focivorming door repressors, waardoor dit faagproteïne mogelijks functioneert in transcriptie-regulatie. Dit ligt in lijn met reeds aangetoonde inhibitie door gp21 van transcriptie en translatie zonder replicatie te beïnvloeden, en het feit dat gp21 niet interageert met andere proteïnen. Echter toonden preliminaire resultaten van DNA-bindigstesten aan dat het proteïne geen substraat- of sequentiespecificiteit in vitro heeft, waardoor geen sluitend bewijs voor deze hypothese kon gevonden worden. 

Het kleine faagproteïne LUZ19 gp5 (< 9 kDa) heeft nuclease activiteit, waardoor het waarschijnlijk het kleinste nuclease ooit geïdentificeerd is. Deze eigenschap leidde tot zijn benaming als ‘Pmd’, verwijzend naar ‘phage-encoded mini-DNase’. De nuclease activiteit werd kwalitatief aangetoond via in vitro DNA-degradatietesten met verschillende substraten, waaruit bleek dat Pmd niet sequentiespecifiek is and actief is als fusieproteïne aan bijvoorbeeld een GST-tag. Pmd is bovendien extreem stabiel; het actief is in een breed pH- (1-10) en temperatuursbereik (10-100°C) en heeft een hogere tolerantie voor denaturerende en reducerende agentia en metaalchelatoren ten op zichte van het commerciële nuclease DNase I. Desondanks kan Pmd geïnactiveerd worden door de metaalchelator citraat, wat kan wijzen op afhankelijkheid van metaalionen voor zijn activiteit. Echter kon de biologische rol van Pmd tijdens faaginfectie nog niet ontrafeld worden. Zo kon de nuclease activiteit nog niet gelinkt worden aan zijn antibacteriële activiteit en bleken initiële studies naar in vivo nuclease-activiteit de hypothese van bacteriële genoomdegradatie voor de productie van nieuwe faaggenomen tijdens infectie te verwerpen. Wel kon een interactiepartner van faag LUZ19 geïdentificeerd worden, namelijk het hypothetische proteïne gp11, welke in de toekomst mogelijks kan helpen om de biologische rol van Pmd te achterhalen.

Tijdens dit onderzoek werden interactiepartners van alle drie de bestudeerde faagproteïnen geïdentificeerd, waardoor hun biologische functie gedeeltelijk ontrafeld kon worden. Hierdoor draagt dit onderzoek bij tot één van de belangrijkste uitdagingen van de faagbiologie, namelijk de kloof tussen het groot aantal hypothetische faagproteïnen en hun biologische functies verkleinen. Verder werd in dit onderzoek een eerste viraal proteïne dat het bacteriële quorum sensingsysteem gebruikt om een efficiënte faaginfectie te bewerkstellingen, gevonden. Deze bevinding bewijst het belang van quorum sensing tijdens virale infecties. Daarnaast werd een volledig ongekend interactienetwerk in P. aeruginosa geïdentificeerd, waarin quorum sensing gelinkt kon worden aan de biosyntheseweg van een niet-gekarakteriseerd, niet-ribosomaal peptide en twee cofactor-biosynthesewegen, nl. van thiamine-pyrofosfaat en coenzyme A. Dit toont aan dat het gedetailleerd onderzoeken van hypothetische faagproteïnen verder kan gaan dan enkel inzichten verkrijgen in faagbiologie. Bovendien zijn er indicaties dat gp21 mogelijks de eerste transcriptierepressor geïdentificeerd is dat gecodeerd wordt door een strikt lytische faag. Ten slotte heeft de studie van Pmd een nieuw licht geworpen op een goedbestudeerde klasse van enzymen, namelijk de nucleasen, aangezien het geen sequentiesimilariteit vertoont met andere nucleasen, unieke eigenschappen heeft qua stabiliteit en buitengewoon klein is.

De inzichten die verkregen werden in de geïdentificeerde faag-gastheerinteracties kunnen in de toekomst mogelijks leiden tot de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële therapieën. Zo zijn Qst and Pmd interessante studieobjecten voor de ontwikkeling van nieuwe antibiofilmgeneesmiddelen, die momenteel naast antibiotica toegepast worden om bacteriële infecties efficiënter te behandelen. Qst blijkt namelijk in te werken op quorum sensing, dat op zijn beurt de vorming van biofilmen reguleert. Pmd daarentegen heeft nuclease activiteit, waardoor het naar verwachting de extracellulaire matrix van biofilmen kan afbreken. Naast zijn medische toepassing heeft Pmd ook potentieel in laboratoria en industrie, waar DNA-afbraak vaak noodzakelijk is voor bepaalde processen. Daarom werd Pmd gepatenteerd. Hiermee werd aangetoond dat het intensief onderzoeken van toxische faagproteïnen niet enkel inzichten oplevert in faagbiologie, maar ook een basis kan leggen voor de ontwikkeling van innovatieve antibacteriële strategieën en faagafgeleide biotechnologische middelen.

Datum:1 okt 2014 →  11 dec 2019
Trefwoorden:Microbiology, Bacteriophages, Molecular biology
Disciplines:Productie van landbouwdieren, Productie van landbouwgewassen, Landbouw, land- en landbouwbedrijfsbeheer, Andere landbouw, bosbouw, visserij en aanverwante wetenschappen
Project type:PhD project