Ontwikkeling van geïntegreerde beeldvormingstechnieken om individuele HIV partikels te bestuderen tijdens de vroege replicatiestappen

HIV-1 vereist de interactie met verschillende cellulaire cofactoren om zijn replicatiecyclus te volbrengen. In de eerste plaats zal het virale enveloppe proteïne binden aan de CD4-receptor en CXCR4 of CCR5 co-receptor om toegang te verkrijgen tot de gastheercel. Deze interactie resulteert in een membraanfusie en de vrijstelling van het virale capside in het cytoplasma van de gastheercel. Tijdens het transport van het virus naar de celkern wordt het virale RNA omgezet naar dubbelstrengig viraal DNA (vDNA) door het virale reverse transcriptase (RT) enzym; tegelijk start de capside ontmanteling. Aan het nucleaire porie complex zal het viraal capside proteïne interageren met verschillende nucleoproteïnen, componenten van het nucleaire porie complex, om zo toegang te verkrijgen tot de celkern. Daarnaast zijn verschillende cellulaire importfactoren, zoals importine-7, importine-a1, importine-a3 en transportine-SR2 (TRN-SR2) ook geassocieerd met HIV-1 nucleaire import. In 2008 werd TRN-SR2 geïdentificeerd als een HIV-1 cofactor in twee onafhankelijke genoombrede RNAi experimenten en als bindingspartner van HIV-1 integrase (IN). Nadat het virus de celkern heeft kunnen binnendringen, zal het vDNA gebonden worden aan het genoom van de gastheercel door het cellulaire proteïne LEDGF/p75, waarna het onomkeerbaar geïntegreerd zal worden in het cellulaire genoom door IN.

De verschillende stappen van de vroege replicatiecyclus zijn allemaal onderling verbonden en exact getimed. Finaal zal er maar een kleine aantal virussen al deze stappen correct kunnen uitvoeren en leiden tot een productieve infectie. Single virus fluorescentie methoden, door middel van het fluorescent labelen van een viraal proteïne, geven ons de mogelijkheid specifieke stappen van de replicatiecyclus te bestuderen in de cel zelf en dit met een hoge sensitiviteit en selectiviteit. Deze technieken geven ons meer informatie over de intracellulaire locatie van deze processen, eventuele interactiepartners en de dynamica van deze stappen. Dit is zelfs mogelijk in levende cellen.

In hoofdstuk 3 zal ik focussen op een ziekte-veroorzakende TRN-SR2 mutatie en het effect hiervan op HIV-1 replicatie. TRN-SR2, gecodeerd door het TNPO3 gen, transporteert essentiële pre-mRNA splicing proteïnen naar de celkern, bijvoorbeeld ASF/SF2, SC35 en CPSF6. Een adenosine deletie in het stopcodon van TRN-SR2 werd geïdentificeerd als de genetische oorzaak van een spierziekte, meer bepaald van bekkengordeldystrofie 1F (LGMD1F). Deze deletie resulteert in een frameshift waardoor patiënten met LGMD1F een vijftien aminozuren langer TRN-SR2 proteïne bevatten. Voorheen werd reeds aangetoond dat deze verlenging van TRN-SR2 de normale verplaatsing naar de nucleus aantastte, maar het exacte mechanisme waardoor deze mutatie leidt tot LGMD1F is momenteel nog niet opgehelderd. Omwille van de belangrijke rol van TRN-SR2 in HIV-1 nucleaire import, bestudeerde ik het effect van deze TRN-SR2 mutant op HIV-1 replicatie. In deze studie werden verschillende in vitro en cellulaire technieken gebruikt, inclusief het gebruik van fluorescent gelabelde virussen, door IN te koppelen aan een versterkt groen-fluorescerend eiwit (eGFP). We hebben kunnen aantonen dat de HIV-1 replicatie wel degelijk belemmerd wordt in cellijnen die het mutant TRN-SR2 bevatten en zelfs nog meer uitgesproken in primaire cellen van patiënten met LGMD1F. Deze inhibitie kon echter niet verklaard worden door een defecte nucleaire import. Tot slot zal extra onderzoek nodig zijn om het exacte mechanisme op te helderen waarmee deze TRN-SR2 mutant HIV-1 infectie kan blokkeren.

De fluorescent gelabelde virussen maken het mogelijk om afzonderlijke virussen te bestuderen, maar laten het echter niet toe de echte infectieuze partikels te onderscheiden van de grote achtergrond aan niet-infectieuze virussen. Omdat een succesvolle infectie finaal bepaald wordt door de integratie van het vDNA in het gastheer chromosoom, heb ik me in hoofdstuk 4 geconcentreerd op de ontwikkeling van een vDNA labeling strategie die gecombineerd kan worden met de IN gelabelde virussen.

Verschillende HIV-1 specifieke, maar ook aspecifieke DNA visualisatie methoden zijn reeds ontwikkeld, maar de meeste van deze technieken kunnen niet gecombineerd worden met natuurlijk voorkomende fluorescente proteïnen zoals GFP. Daarom hebben we getracht een HIV-1 DNA labeling methode te ontwikkelen die de combinatie met de IN gelabelde virussen wel toe zou laten. Deze techniek is gebaseerd op de azide-alkyne cycloadditie reactie ofwel klikchemie. Infectie zal plaats vinden in de aanwezigheid van nucleosiden met een drievoudige binding die ingebouwd kunnen worden door HIV-1 RT. Vervolgens zullen deze analogen gekoppeld kunnen worden aan een organische fluorescent molecule, waardoor het vDNA fluorescent gelabeld zal worden.

5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) is een commercieel beschikbaar nucleoside analoog dat reeds gebruikt werd in HIV-1 onderzoek. Dit analoog resulteert echter in een aanzienlijke achtergrond kleuring van de gastheercel zelf. Daarom hebben we getracht om nieuwe nucleosiden te ontwikkelen, die selectief en efficiënt ingebouwd kunnen worden door HIV-1 RT.

Zeven verschillende nucleoside analogen met een propargyl-groep werden gesynthetiseerd en geanalyseerd voor hun gebrek aan cytotoxiciteit en virusinhibitie, in vitro RT-specifieke primer verlenging en incorporatie kinetiek, en de mogelijkheid om hiermee het HIV-1 DNA te visualiseren. Een van de analogen (A5) kan in vitro specifiek geïncorporeerd worden door HIV-1 RT, maar in de cel werd geen vDNA visualisatie waargenomen. Twee andere analogen (A3 en A6) daarentegen kunnen in vitro geïncorporeerd worden door HIV-1 RT en humaan mitochondriaal DNA-polymerase γ, en zijn wel in staat om het virale DNA te visualiseren. De incorporatie van deze analogen is echter niet heel efficiënt. Daarboven kan A3 ook gebruikt worden voor het visualiseren van de mitochondriale DNA synthese. Samengevat kon er geen analoog geïdentificeerd worden dat efficiënt en selectief geïncorporeerd kan worden door HIV-1 RT en daarnaast gebruikt kan worden voor de HIV-1 DNA visualisatie in de cel. Deze resultaten kunnen echter wel dienen als basis voor een verdere chemische optimalisatie om zo uiteindelijk een meer specifieke en efficiënte HIV-1 DNA visualisatie strategie te ontwikkelen.